【佳學(xué)基因檢測】胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識（2018版）
本文轉(zhuǎn)載自“中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志”。
基因解碼導(dǎo)讀：隨著輔助生殖技術(shù)臨床開展規(guī)模的日益擴大，以及細胞及分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)的快速發(fā)展，胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)和植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)技術(shù)迎來了快速的增長和發(fā)展。為使該項技術(shù)更加規(guī)范且有效地實施，經(jīng)中國婦幼保健協(xié)會生育保健專業(yè)委員會、中國醫(yī)師協(xié)會生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會、中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分會、中國遺傳學(xué)會遺傳咨詢分會和中國婦幼健康研究會生殖內(nèi)分泌專業(yè)委員會專家討論，結(jié)合國際發(fā)展動態(tài)和國內(nèi)臨床應(yīng)用的實際情況，達成以下臨床和實驗室專家共識。
更先進部分PGD/PGS的臨床流程與質(zhì)控
1 適應(yīng)證和禁忌證
1.1 PGD的適應(yīng)證
1.1.1 染色體異常
夫婦任一方或雙方攜帶染色體結(jié)構(gòu)異常，包括相互易位、羅氏易位、倒位、復(fù)雜易位、致病性微缺失或微重復(fù)等。
1.1.2 單基因遺傳病
具有生育常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖隱性遺傳、X連鎖顯性遺傳、Y連鎖遺傳等遺傳病子代高風險的夫婦，且家族中的致病基因突變診斷明確或致病基因連鎖標記明確。
1.1.3 具有遺傳易感性的嚴重疾病
夫婦任一方或雙方攜帶有嚴重疾病的遺傳易感基因的致病突變，如遺傳性乳腺癌的BRCA1、BRCA2致病突變。
1.1.4 人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)配型
曾生育過需要進行骨髓移植治療的嚴重血液系統(tǒng)疾病患兒的夫婦，可以通過PGD選擇生育一個和先前患兒HLA配型相同的同胞，通過從新生兒臍帶血中采集造血干細胞進行移植，救治患病同胞。
1.2 PGS的適應(yīng)證
近期高通量遺傳檢測技術(shù)(PGS 2.0版)的研究和發(fā)展，對PGS的臨床意義提出了新的質(zhì)疑，包括不同程度和部位胚胎染色體異常嵌合型的存在、臨床檢測技術(shù)的正確性、對移植胚胎的選擇和放棄的標準、PGS的活產(chǎn)率計算方式及其應(yīng)用價值等，提示PGS的循證證據(jù)尚需進一步的研究和驗證，其指征也面臨修正和更新。目前PGS可應(yīng)用于以下幾個方面：
1.2.1 女方高齡(advanced maternal age，AMA) 女方年齡38歲及以上。
1.2.2 不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM) 反復(fù)自然流產(chǎn)2次及以上。
1.2.3 不明原因反復(fù)種植失敗(recurrent implantation failure，RIF) 移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數(shù)4～6個或高評分囊胚數(shù)3個及以上均失敗。
1.2.4 嚴重畸精子癥
1.3 PGD的禁忌證 有以下情況之一者，不得實施PGD技術(shù)：
1.3.1 目前基因診斷或基因定位不明的遺傳性疾病。
1.3.2 非疾病性狀的選擇，如性別、容貌、身高、膚色等。
1.3.3 其他不適宜實施PGD的情況。
1.4 其他幾種特殊情況
1.4.1 性染色體數(shù)目異常
如47，XYY、47，XXX等，產(chǎn)生性染色體異常后代的幾率較低[1,2]，不建議實施PGD；而47，XXY生育后代染色體異常風險增加[3]，可酌情考慮是否實施PGD。
1.4.2 對于常見的染色體多態(tài)
如1qh＋、9qh＋、inv(9)(p12q13)、Yqh＋等，不建議PGD。
2 遺傳咨詢和知情同意
患者夫婦在選擇實施PGD/PGS前，需要接受至少一次的遺傳咨詢，使其充分了解自身的生育和遺傳風險，知曉現(xiàn)階段可能的醫(yī)學(xué)干預(yù)措施及其利弊，自愿選擇治療方式，并保存相關(guān)咨詢記錄資料。
2.1 病史采集及家系分析
包括收集患者及相關(guān)家系成員的原始臨床資料及遺傳檢測結(jié)果，繪制系譜圖；詢問夫婦雙方的疾病史、生育史、?？茩z查及健康評估結(jié)果；對于HLA配型者，需評估患兒目前的病情及診治情況，判斷其病情是否允許等待。
2.2 風險評估
結(jié)合家系調(diào)查和遺傳檢測結(jié)果，以及相關(guān)疾病的一般遺傳發(fā)病規(guī)律，充分評估夫婦的再生育風險。
2.3 知情選擇
根據(jù)評估的生育風險告知可能的干預(yù)措施，如產(chǎn)前診斷、PGD/PGS、配子捐贈等，以及現(xiàn)階段不同干預(yù)技術(shù)方案的優(yōu)缺點，讓夫婦自愿選擇生育干預(yù)措施。夫婦在選擇PGD/PGS周期治療前，需充分知曉整個過程中的各類風險，涉及常規(guī)體外受精的治療過程、PGD/PGS技術(shù)造成的胚胎活檢、冷凍復(fù)蘇損傷、個別胚胎可能診斷不明、檢測后無可移植胚胎、染色體嵌合型胚胎發(fā)育潛能的不確定性、無法常規(guī)鑒別染色體結(jié)構(gòu)異常的攜帶者、由于胚胎自身的生物學(xué)特性以及檢測技術(shù)的局限性可能導(dǎo)致誤診的風險、以及若獲得持續(xù)妊娠，需行產(chǎn)前診斷確診等。
3 胚胎移植
3.1 行PGD/PGS檢測后的胚胎，建議行單胚胎移植。
3.2 當本周期無有效正常的可移植胚胎時，患者經(jīng)遺傳咨詢和知情同意后，可自愿選擇移植非整倍體嵌合體異常胚胎[4]，并依順序優(yōu)先選擇移植不良風險較小的嵌合型胚胎。
3.3 在對單基因疾病實施PGD時，攜帶致病基因突變但很可能不發(fā)病的胚胎可作為備選移植胚胎。
3.4 可選擇新鮮周期移植或者復(fù)蘇周期移植。
4 隨訪
PGD胚胎移植后獲得持續(xù)妊娠者，需進行侵入性產(chǎn)前診斷?，F(xiàn)階段不建議采用產(chǎn)前篩查的方法，并應(yīng)隨訪妊娠的結(jié)局以及新生兒的情況。
5 臨床質(zhì)控
5.1 夫婦在進入PGD/PGS治療周期前，需接受至少一次遺傳咨詢，并保存完整的咨詢記錄、知情同意書和病案記錄。
5.2 確定接受PGD/PGS周期治療的夫婦的臨床指征合理且充分。
5.3 PGD獲得持續(xù)妊娠者，產(chǎn)前診斷結(jié)果與胚胎檢測結(jié)果符合率>98%。
5.4 對PGD/PGS的臨床結(jié)局分析，建議使用活產(chǎn)率/每起始周期的統(tǒng)計方法。
第二部分胚胎實驗室的顯微操作與質(zhì)控
1 授精方式的選擇
1.1 卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)
PGD/PGS周期建議采用ICSI授精方式，以賊大限度地減少母源顆粒細胞和父源精子對下游遺傳學(xué)檢測正確性的干擾，特別是下游檢測擬采用核酸擴增技術(shù)者。
1.2 常規(guī)體外受精(in vitro fertilization，IVF)
使用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)方法進行胚胎遺傳學(xué)檢測時，也可采用IVF授精后形成的囊胚，但應(yīng)警惕精子和其他細胞核的污染。
2 活檢的時機
2.1 極體活檢
通過極體活檢進行PGD/PGS，可分析判定母源遺傳信息。
2.1.2 更先進極體活檢：可在取卵后實施，也可在ICSI后0.5～2 h進行。
2.1.3 第二極體活檢：在ICSI后8～14 h第二極體排出后進行。
2.1.4 在ICSI受精后8～14 h內(nèi)，可同時活檢獲取更先進極體和第二極體。
2.2 卵裂期活檢
卵裂期活檢一般在授精后66～70 h進行，對此時發(fā)育至6～8細胞、碎片含量< 30%的胚胎進行活檢。通?；顧z1個卵裂球，賊多不超過2個。在卵裂期活檢后，胚胎仍可繼續(xù)生長發(fā)育2～3天，成為囊胚。在該時間段內(nèi)若能完成胚胎遺傳學(xué)診斷，則可實行新鮮周期移植。
2.3 囊胚活檢
囊胚活檢對胚胎發(fā)育的潛力影響較小，已成為目前PGD/PGS的主要活檢方式。囊胚期活檢是在授精后第5～6天、囊胚充分擴張后進行。建議活檢囊胚評分應(yīng)在4BB以上，活檢細胞數(shù)以5～10個為宜。通常囊胚活檢后的胚胎需立即冷凍保存，待胚胎遺傳學(xué)分析完成后，擇期對結(jié)果正常的胚胎進行復(fù)蘇移植。
3 胚胎活檢
3.1 透明帶打孔
3.1.1 透明帶打孔的方法有機械法、Tyrodes酸法和激光法。目前激光法更為常用，在活檢時應(yīng)盡量避免對細胞造成熱損傷。
3.1.2 機械法打孔和激光法可以用于授精前的極體活檢，Tyrodes酸法可能對紡錘體產(chǎn)生不利影響。
3.1.3 卵裂期或囊胚期活檢可以采用機械法、Tyrodes酸法和激光法。
3.1.4 囊胚活檢的透明帶打孔可以在授精后第3天、第5天、活檢前4 h或活檢時進行。
3.2 活檢細胞的數(shù)目
應(yīng)根據(jù)遺傳檢測的要求，單獨或同時移取更先進或第二極體；卵裂期活檢應(yīng)移取1～2個細胞。若需移取2個細胞，則活檢胚胎應(yīng)包含≥ 6個細胞；囊胚活檢采集的滋養(yǎng)細胞數(shù)目應(yīng)控制在5～10個。
3.3 二次活檢
反復(fù)活檢將影響胚胎的發(fā)育潛力。但在新穎活檢診斷不明時，可以考慮二次活檢(包括卵裂期胚胎和囊胚)；如果胚胎活檢后已冷凍，可以考慮復(fù)蘇后再次活檢[5]。
3.4 選擇活檢的細胞
在卵裂期活檢卵裂球時，應(yīng)選擇移取有核且為單核的細胞，囊胚活檢應(yīng)選擇遠離內(nèi)細胞團的部位。
4 活檢胚胎的冷凍
在等待PGD/PGS遺傳學(xué)檢測結(jié)果時，需要對活檢后的胚胎進行冷凍保存。建議采用玻璃化冷凍技術(shù)，活檢后的卵裂期或囊胚期的冷凍方法與常規(guī)胚胎冷凍方法相同。
5 活檢樣本的預(yù)處理
5.1 核酸擴增法檢測的預(yù)處理
下游采用核酸擴增法進行遺傳學(xué)檢測者，活檢所移取的細胞經(jīng)過洗滌后應(yīng)放入含有2.5 μL磷酸鹽緩沖液(或遺傳檢測試劑盒所要求的預(yù)裝試劑)的PCR管中，同時移取少許洗滌液到空白PCR管中作為空白對照。
5.2 FISH檢測的預(yù)處理
不同的細胞固定方法均可以獲得滿意的效果；在處理時應(yīng)注意做好固定液的隔離防護措施。
6 胚胎活檢實驗室的質(zhì)量控制
6.1 胚胎活檢環(huán)境的質(zhì)量控制
6.1.1 同ICSI體外胚胎操作實驗室標準，在百級層流、37℃恒溫、覆蓋于無菌礦物油下的無菌培養(yǎng)液滴中進行。
6.1.2 為減少胚胎之間的相互污染，必須盡力做到每個微滴中僅包含一個胚胎，活檢針和活檢材料轉(zhuǎn)移吸管須無活檢細胞成分的殘留。
6.2 胚胎活檢人員的質(zhì)量控制
胚胎活檢技術(shù)人員應(yīng)具備熟練的ICSI操作經(jīng)驗，在操作中全程遵循嚴格的無菌原則，以防外源性污染。
第三部分遺傳實驗室的遺傳檢測與質(zhì)控
根據(jù)胚胎遺傳檢測的靶標，又可分為基因水平的檢測和染色體水平的檢測。
1 基因水平的檢測
1.1 適用范圍
經(jīng)過規(guī)范的臨床咨詢，明確具有單基因遺傳病高風險的夫婦；夫妻雙方或之一攜帶有嚴重疾病明確的遺傳易感基因致病突變；HLA配型選擇。
1.2 檢測策略和原則要求
1.2.1 為避免因擴增失敗、優(yōu)勢擴增、等位基因脫扣(allele drop-out，ADO)、樣本污染等導(dǎo)致的誤診或診斷不明，建議PGD的胚胎基因檢測應(yīng)同時進行突變位點的直接分析和遺傳多態(tài)位點連鎖分析[6,7]。
1.2.2 用于連鎖分析的遺傳多態(tài)位點可以是短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)或者單核苷酸多態(tài)位點(single nucleotide polymorphism，SNP)。
1.2.3 建議在致病突變位點上、下游1 Mb的范圍內(nèi)分別選擇至少2個可提供遺傳信息的多態(tài)位點，同時避免選擇同源性高、相鄰序列中GC含量高或有多聚核苷酸序列的SNP位點。
1.2.4 對于性連鎖遺傳病，建議加入性別指示位點的檢測。
1.2.5 對于HLA配型者，用于連鎖分析的遺傳多態(tài)位點需要覆蓋HLA-A、HLA-B、HLA-DRA和HLA-DQB1的上、下游，在每個區(qū)域中至少選擇5個可提供遺傳信息的多態(tài)位點。
1.2.6 在進行遺傳多態(tài)位點連鎖分析時，需注意突變位點附近的基因組重組。
1.3 檢測方法
1.3.1 巢式PCR法
其中更先進輪多重PCR應(yīng)擴增多個目標位點(含突變位點以及連鎖遺傳的多態(tài)位點)。
1.3.2 全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)
又可分為基于PCR原理和非基于PCR原理的擴增方法。WGA擴增的產(chǎn)物可采用多種方法進行突變位點及遺傳連鎖位點的鑒定，包括熒光PCR、Sanger測序、單核苷酸多態(tài)微陣列芯片(SNP array)[8,9]、高通量測序(next generation sequencing，NGS)[6]以及聯(lián)合檢測等。
1.4 PGD檢測前的驗證
1.4.1 在施行PGD前，需要在家系樣本中對已知致病突變進行驗證。
1.4.2 應(yīng)選擇突變位點上、下游的多態(tài)位點，在家系樣本中進行連鎖分析，從中選擇能夠提供遺傳信息的位點建立單體型圖。
1.4.3 在單個細胞水平驗證PGD檢測方案的有效性
1.4.3.1 在實施PGD檢測前，需要在單個細胞上驗證方案的見效率，評估目標檢測位點擴增的有效性以及ADO率。
1.4.3.2 驗證樣本可以是淋巴細胞、顆粒細胞、口腔粘膜細胞、胚胎細胞等，應(yīng)注意來源的細胞可能影響擴增的效率和ADO率。
1.4.3.3 采用卵裂期活檢者，每份驗證樣本應(yīng)包含1個細胞；采用囊胚活檢者，每份驗證樣本應(yīng)包含4～10個細胞。
1.4.3.4 若采用直接PCR擴增法，建議在50份驗證樣本(可能的話，包括攜帶有致病突變的細胞以及正常細胞)中進行預(yù)驗證檢測。
1.4.3.5 采用WGA法進行更先進步擴增者，建議至少在10份驗證樣本中進行預(yù)驗證檢測。
1.4.3.6 擴增效率應(yīng)>90%，ADO率應(yīng)<10%。若ADO率較高，可適當增加上、下游的連鎖遺傳多態(tài)位點進行分析[10]。
2 染色體水平的檢測
2.1 適用范圍
夫妻雙方或之一攜帶有染色體異常；醫(yī)療目的的性別選擇；胚胎植入前的非整倍體篩查。
2.2 檢測策略和原則要求
2.2.1 對于夫妻雙方或之一攜帶有染色體異常者，PGD可以僅針對異常染色體進行檢測，也可同時分析其他染色體的數(shù)目異常。
2.2.2 性別選擇可以用于基因診斷不明的性連鎖遺傳病。但對于基因診斷明確的家系，建議進行突變基因分析，不建議單純進行性別選擇。
2.2.3 對于Y連鎖單基因疾病，可僅進行性別選擇。
2.2.4 對于染色體結(jié)構(gòu)易位，PGD檢測可不鑒別攜帶者。有條件的實驗室可以提供攜帶者檢測，但需要充分評估檢測所采用的技術(shù)。
2.2.5 對于胚胎非整倍體篩查，建議采用能夠同時分析所有染色體數(shù)目異常的方法(comprehensive chromosome screening，CCS)，不建議采用FISH技術(shù)。
2.3 檢測方法
2.3.1 核酸擴增法
2.3.1.1 巢式PCR法
首輪多重PCR應(yīng)同時擴增目標染色體的特異性位點，第二輪定量PCR應(yīng)進行各染色體位點拷貝數(shù)分析[11]。
2.3.1.2 WGA結(jié)合高通量遺傳檢測技術(shù)
在WGA檢測后，可采用多種高通量遺傳檢測技術(shù)進行染色體拷貝數(shù)檢測，如微陣列比較基因組雜交(array CGH)[12,13]、單核苷酸多態(tài)微陣列芯片(SNP array)[14,15]、高通量測序(NGS)[16,17]等。
2.3.2 FISH檢測
應(yīng)針對檢測的目標染色體，選擇不同的核酸探針。在檢測染色體易位攜帶者所產(chǎn)生的胚胎時，所選的探針組合需要能夠識別所有可能的易位相關(guān)的染色體不平衡胚胎。當染色體易位片段較小、超出高通量遺傳學(xué)檢測技術(shù)的有效分辨率時，應(yīng)優(yōu)先選擇FISH檢測。
2.4 臨床實施PGD/PGS前對于方案有效性的驗證
2.4.1 array CGH、SNP array、NGS等技術(shù)已有商品化試劑盒，具有標準化的操作流程和質(zhì)控參數(shù)，本地實驗室在新穎臨床應(yīng)用前，需驗證檢測平臺的有效性和穩(wěn)定性。通常無需對每個病例進行臨床前預(yù)實驗。
2.4.2 采用FISH進行染色體拷貝數(shù)分析，需提前驗證患者夫婦外周血中期染色體的核型，同時在間期核上檢測分析探針的熒光強度及特異性。
3 質(zhì)量控制
各臨床PGD/PGS實驗室應(yīng)根據(jù)自身的條件和特色，自主選擇檢測技術(shù)平臺。各種檢測方法均需建立標準操作規(guī)程(standard operating procedure，SOP)。不同的檢測技術(shù)平臺應(yīng)根據(jù)具體流程的需要在實驗關(guān)鍵環(huán)節(jié)設(shè)置質(zhì)控參數(shù)。本指南僅對PGD實驗室的一般質(zhì)控措施提出以下建議：
3.1 采用核酸擴增法進行PGD/PGS檢測的實驗室需嚴格遵照《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》的一般原則。
3.2 胚胎活檢的細胞及其在整個檢測流程中需具有清晰且先進的編號，與胚胎一一對應(yīng)。
3.3 采用核酸擴增法進行PGD/PGS檢測時，新穎擴增步驟需要設(shè)置細胞洗滌液空白對照以及擴增試劑空白對照以評估可能的污染及來源。
3.4 各種檢測技術(shù)需均建立SOP文件并遵照執(zhí)行，并及時評估更新。
3.5 對于采用商品化試劑盒檢測技術(shù)如array CGH、SNP array、NGS等，需建立適用于本地實驗室的SOP程序和質(zhì)控方法。
3.6 所有實驗操作過程中需要嚴格的雙人核對，實時記錄并簽字。
3.7 檢測結(jié)果數(shù)據(jù)需要兩人獨立分析判讀，賊后由第三人審核判斷。未達成一致意見的胚胎應(yīng)判讀為診斷不明。PGD中診斷不明的胚胎不建議移植。
3.8 應(yīng)定期開展室內(nèi)比對和室間比對質(zhì)控，并做好記錄。
4 檢測報告
PGD/PGS報告需包括患者夫婦的姓名、年齡、檢測指征、胚胎編號、胚胎活檢階段、活檢日期、檢測方法和項目、檢測結(jié)果、檢測者、審核者、報告日期及備注說明。除醫(yī)療目的性別鑒定外，報告不準提示胚胎的性別。
(責任編輯：佳學(xué)基因)
