【佳學(xué)基因檢測(cè)】血液系統(tǒng)疾病的基因矯正治療

遺傳病、罕見(jiàn)病基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

佳學(xué)基因在掌握了造血干細(xì)胞（HSCs）的分離和擴(kuò)增特性以后，可以對(duì)免疫系統(tǒng)及造血系統(tǒng)進(jìn)行修改和重建，從而在細(xì)胞和基因治療發(fā)展的前沿開展研究和產(chǎn)業(yè)化工作?；蚪M編輯技術(shù)的最新進(jìn)展，特別是聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）和CRISPR/Cas衍生的編輯系統(tǒng)，改變了基因治療的格局。這一工具系統(tǒng)應(yīng)用的靈活性及其在基因的失活、矯正及插入方面的應(yīng)用拓寬了可以進(jìn)行基因治療的靶標(biāo)，使得我們可以通移植經(jīng)過(guò)修改的造血干細(xì)胞來(lái)開發(fā)一系列罕見(jiàn)疾病的治療方案?；虺C正技術(shù)和特色在于更高的編輯效率和更正確的基因修改位置，治療方案的可耐受性更好，更容易運(yùn)輸進(jìn)行異地治療及更低的治療費(fèi)用。為了得到患者、監(jiān)管機(jī)構(gòu)及社會(huì)大眾對(duì)這一先進(jìn)治療方案的理解，佳學(xué)基因綜述了造血干細(xì)胞的基因編輯在遺傳病治療方面的進(jìn)展。介紹了這一技術(shù)的臨床前實(shí)驗(yàn)及臨床研究中最有意義的發(fā)現(xiàn)。本文通過(guò)介紹以造血干細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療，討論了基因組編輯在臨床轉(zhuǎn)化中所遇到的困難。同時(shí)也指出基因編輯技術(shù)的進(jìn)展將促進(jìn)普通疾病及其以外更多疾病的應(yīng)用。

血液及免疫系統(tǒng)疾病的基因解碼

血紅蛋白病、原發(fā)性免疫缺陷（PIDs）和先天性血細(xì)胞減少癥都有一個(gè)主要的共同點(diǎn)：它們是由造血干細(xì)胞（HSC）內(nèi)的遺傳序列異常引起的遺傳性血液病，影響一個(gè)或多種血液細(xì)胞的產(chǎn)生和功能。[1] 原則上，這些疾病中的每一種都可以通過(guò)用基因正常的造血干細(xì)胞替換有問(wèn)題的突變?cè)煅杉?xì)胞來(lái)治好，然后這些造血干細(xì)胞又可以重建一個(gè)全新的功能性血液淋巴系統(tǒng)。自1968年Good及其同事新穎成功將HSC移植到患有X連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（X-SCID）的兒童身上以來(lái)，異基因HSC移植（HSCT）已成為此類遺傳性疾病患者唯一的治療選擇[2]。然而，迄今為止，異基因造血干細(xì)胞移植的廣泛應(yīng)用受到需要合適的人類白細(xì)胞抗原（HLA）相容供體的要求的限制以及移植前需要采用細(xì)致的清髓預(yù)處理方案的限制，這可能導(dǎo)致不孕、繼發(fā)性惡性腫瘤和器官損傷[3]。移植過(guò)程中頻繁的短期和長(zhǎng)期副作用，如免疫抑制方案引起的感染、移植物排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病，進(jìn)一步阻礙了HSCT的發(fā)展。在目前的實(shí)踐中，只有50%的患者有合適的HLA相合供體，可以進(jìn)行HSCT，并且移植死亡率高達(dá)20%[4,5,6]。

由于這些限制，自體HSC基因治療的想法，即患者自身的突變HSC基因經(jīng)過(guò)基因改造，得到了發(fā)展，因?yàn)樗鼮榇罅垦翰√峁┝艘环N潛在的終生治療，而無(wú)需HLA匹配的供體，不會(huì)出現(xiàn)相關(guān)的免疫并發(fā)癥。此外，在自體環(huán)境中，移植前降低了強(qiáng)度的治療可以使血液淋巴細(xì)胞系統(tǒng)更快地重建，并有助于患者獲得列好的生存結(jié)果[7,8]。最初，自體HSC基因治療主要通過(guò)整合病毒或非病毒基因傳遞系統(tǒng)，在HSCs中通過(guò)添加致病基因的一個(gè)具有正常功能的基因拷貝來(lái)實(shí)現(xiàn)[9]。早期臨床試驗(yàn)證明，病毒介導(dǎo)的有效基因轉(zhuǎn)移治療多種危及生命或孤兒血液疾病，不僅包括先天性造血障礙：鐮狀細(xì)胞病（SCD）和β地中海貧血[10,11,12,13]；Fanconi貧血（FA）[14]；免疫機(jī)能缺陷癥，Wiskott–Aldrich綜合征（WAS）[15,16]和X-SCID[17]；也包括代謝儲(chǔ)存障礙，如X-連鎖腎上腺髓白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（X-ALD）[18,19]和變色性白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（MLD）[20]。然而，仍然存在若干困難。首先，最有效的病毒傳遞系統(tǒng)的包裝能力限制了治療性轉(zhuǎn)基因，從而限制了通過(guò)基因添加方法可以治療的疾病。其次，對(duì)于功能獲得性有害突變，單純添加蛋白質(zhì)編碼基因不能實(shí)現(xiàn)功能矯正。第三，有效基因加入方法的一個(gè)主要缺點(diǎn)是治療基因整合位點(diǎn)不可預(yù)測(cè)，因此，插入突變、癌基因反式激活和轉(zhuǎn)基因、鄰近基因異常表達(dá)的是這一方法的內(nèi)在缺點(diǎn)[21,22,23,24,25]。相反，盡管進(jìn)行了大量的研究工作，但通過(guò)應(yīng)用概念上更安全、非整合性載體的方法進(jìn)行疾病校正仍然是短暫和低效的[26,27]。因此，綜合起來(lái)，基因添加具有固有的安全性和效率缺陷，這就使得尋找替代基因治療方法成為合情合理的事情。

可編程核酸酶技術(shù)的最新進(jìn)展，包括鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶（TALENs）、聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）以及最近基于CRISPR/Cas的表觀遺傳學(xué)，堿基及引物編輯系統(tǒng)從策略上改變了基因治療方法。與非靶向基因添加載體相比，可編程核酸酶及其衍生物具有識(shí)別和結(jié)合特定基因組位點(diǎn)的能力，從設(shè)計(jì)理念上具有安全優(yōu)勢(shì)，從而能夠糾正致病突變或位點(diǎn)特異性破壞和整合事件，而沒(méi)有內(nèi)在的插入突變風(fēng)險(xiǎn)[28]。對(duì)于許多遺傳性疾病來(lái)說(shuō)，受影響基因的生理性和高水平表達(dá)是必不可少的，這很容易通過(guò)基因編輯工具獲得，而且它們有能力來(lái)恢復(fù)正常的基因組序列，而象基因添加方法那樣需要減少編碼或調(diào)控序列。作為一種更安全，盡管目前效率較低的非靶向基因添加的替代方法，基因編輯工具還允許在所謂的“安全港”基因座上有針對(duì)性地插入整個(gè)表達(dá)盒，或者在缺陷基因位點(diǎn)正確添加或替換功能性無(wú)啟動(dòng)子序列，以便在內(nèi)源性控制元件下進(jìn)行控制[29,30]。與非靶向插入相比，后一種方法還可以處理毒性獲得性功能突變，而與突變特異性正確修復(fù)相比，前一種方法還可以處理大的缺失或多個(gè)功能缺失突變。在過(guò)去的十年中，大量的臨床前研究為基因編輯自體造血干細(xì)胞的治療潛力提供了概念證明，最近的基因編輯治療血紅蛋白病的臨床試驗(yàn)結(jié)果證明了這一點(diǎn)[31]。因此，更多可通過(guò)自體基因修飾的造血干細(xì)胞（見(jiàn)圖1）靶向的遺傳性疾病或疾病傾向可能很快進(jìn)入臨床試驗(yàn)及以后的開發(fā)階段。盡管正在進(jìn)行的研究在解決問(wèn)題的同時(shí)仍然揭示了基因編輯的許多潛在陷阱，盡管在技術(shù)領(lǐng)域和監(jiān)管軌道上仍然存在許多障礙，但在過(guò)去十年中，基因編輯技術(shù)的發(fā)展取得了驚人的進(jìn)展。在此，我們簡(jiǎn)要回顧主要基因組編輯技術(shù)（ZFN、TALENs、CRISPR/Cas9）的主要特點(diǎn)，并提供了當(dāng)前HSC基因編輯治療方法的最新概況，強(qiáng)調(diào)了主要成就和仍然存在的挑戰(zhàn)。此外，針對(duì)相應(yīng)的臨床前和臨床研究結(jié)果，我們總結(jié)了遺傳性血液病突變特異性基因組編輯領(lǐng)域的一些突破。最后，我們批判性地討論了如何解決當(dāng)前的局限性和關(guān)注點(diǎn)，以促進(jìn)這些療法在臨床上的應(yīng)用。

通過(guò)編輯HSC可能治好的典型遺傳性疾病一覽圖。與每種疾病相關(guān)的基因在括號(hào)中標(biāo)明。給出的細(xì)胞類型表明蛋白質(zhì)表達(dá)或表型校正最明顯的地方。請(qǐng)注意，聯(lián)合免疫缺陷影響B(tài)細(xì)胞功能，即使在表現(xiàn)為B+表型。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（MΦ）也可能作用于造血系統(tǒng)外的細(xì)胞并用于疾病糾正（未顯示）。紅細(xì)胞（RB)，自然殺傷細(xì)胞(NK)。

造血干細(xì)胞基因編輯框架

基因編輯工具概述

早期對(duì)靶向基因編輯的嘗試依賴于將帶有同源臂的供體質(zhì)粒傳遞到靶序列，并依賴細(xì)胞同源重組機(jī)制的自發(fā)作用來(lái)促進(jìn)編輯或定點(diǎn)整合。在開發(fā)合適的工具來(lái)增加靶位點(diǎn)的重組事件之前，這種方法的低效率和校正頻率不適合治療應(yīng)用。隨著雙鏈斷裂（DSBs）在受影響的位點(diǎn)刺激內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制的作用的發(fā)現(xiàn)，許多可編程核酸酶能夠在不同的位點(diǎn)誘導(dǎo)DSBs，用于基因研究和基因治療。迄今為止最流行的基于DSB的編輯平臺(tái)包括ZFN、TALENs和RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶。核酸酶誘導(dǎo)的DNA斷裂主要通過(guò)兩種內(nèi)源性途徑修復(fù)，（i）易出錯(cuò)的非同源末端連接（NHEJ）途徑，該途徑在整個(gè)細(xì)胞周期中通過(guò)連接DNA末端來(lái)糾正DSB，但偶爾會(huì)導(dǎo)致DSB位點(diǎn)的插入或缺失（INDEL），或者（ii）高保真同源定向修復(fù)（HDR）途徑，該途徑僅限于細(xì)胞周期的G2/S期，并且需要同源序列的存在作為修復(fù)DSB的模板[32]。通常，NHEJ被用于基因的破壞、敲除、反轉(zhuǎn)或標(biāo)記，而HDR被用于在特定基因組位點(diǎn)正確引入所需的序列改變（缺失、替換或插入）。

每個(gè)核酸酶平臺(tái)基于一個(gè)可定制的序列特異性DNA結(jié)合域和一個(gè)非特異性DNA切割域。對(duì)于ZNF和TALEN，DNA分別與同名的鋅指和Tal效應(yīng)器核酸酶域結(jié)合；對(duì)于CRISRP/Cas，DNA與單鏈導(dǎo)向RNA結(jié)合；對(duì)于ZFNs和TALENs，DNA由二聚體FokI核酸酶切割；對(duì)于CRISPR/Cas，DNA與由單體Cas切割。表1概述了研究最廣泛的基因編輯技術(shù)的主要特點(diǎn)。ZF結(jié)構(gòu)域首先在非洲爪蟾的轉(zhuǎn)錄因子IIIa而TALE結(jié)構(gòu)域首先在黃單胞菌的中發(fā)現(xiàn)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域分別識(shí)別3個(gè)和1個(gè)堿基對(duì)。這些共價(jià)連接到FokI核酸內(nèi)切酶的識(shí)別域的模塊化串聯(lián)允許兩個(gè)ZFN或TALEN單體結(jié)合到預(yù)定切割位點(diǎn)任一側(cè)的對(duì)側(cè)DNA鏈上，這導(dǎo)致FokI的活性二聚體形式的靶特異性切割。另一方面，雖然ZFN和TALEN的設(shè)計(jì)比舊的編輯平臺(tái)更容易[33]，但由于需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)工程和克隆操作方案[34,35]，ZFN和TALEN的生成過(guò)程都很費(fèi)勁，這使得為新靶點(diǎn)設(shè)計(jì)有效的核酸酶成為基因編輯領(lǐng)域的瓶頸。2012年，從抗病毒細(xì)菌免疫系統(tǒng)中衍生出RNA引導(dǎo)、序列特異性CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)，可以消除這些限制，從而改變編輯領(lǐng)域。在其工程形式中，CRISPR/Cas包含Cas9核酸內(nèi)切酶和攜帶20個(gè)核苷酸靶識(shí)別序列的單一導(dǎo)向RNA鏈（sgRNA）。它的唯局限是是額外需要一個(gè)短的（通常是3-5個(gè)核苷酸）的原始間隔序列領(lǐng)近模塊，由使用的Cas分子決定。CRISPR/Cas平臺(tái)提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、通用、廉價(jià)和可預(yù)測(cè)的基因編輯平臺(tái)[36,37]。該系統(tǒng)的兩個(gè)主要缺點(diǎn)是（i）依賴于裂解近端PAM位點(diǎn)，這已通過(guò)選擇或設(shè)計(jì)具有改變或放松序列要求的Cas分子來(lái)解決[29,38,39]，以及（ii）單體分子技術(shù)相對(duì)較低的靶向特異性和保真度，以及相對(duì)較高的脫靶活性，其最常見(jiàn)的解決方法是使用nickase-Cas分子的二聚體，通過(guò)使用或設(shè)計(jì)（高保真度）Cas分子，減少非特異性DNA相互作用，并通過(guò)更瞬時(shí)的CRISPR/Cas傳遞[40]。在臨床應(yīng)用方面，特異性增強(qiáng)策略隨后輔以候選核酸酶的脫靶評(píng)估，通過(guò)飽和評(píng)估潛在的脫靶位點(diǎn)或全基因組方法，可以為下游應(yīng)用選擇最高特異性工具。

然而，即使是對(duì)于高度特異性設(shè)計(jì)的核酸酶，對(duì)精密修復(fù)的有效性和應(yīng)用的一般安全性仍然存在更多的顧慮。最近在提高HDR的效率方面取得了重大進(jìn)展，基于DSB的正確編輯即使在原始HSC[41,42,43,44,45]，臨床應(yīng)用HDR的效率也有所提高，但仍有人擔(dān)心DSB的使用，因?yàn)樗赡軙?huì)選擇凋亡缺陷細(xì)胞[41,46，47]或引發(fā)意外重組事件[48,49]?；贒SB的精密修復(fù)的效率考慮和對(duì)臨床應(yīng)用安全性的嚴(yán)重關(guān)注，催生了對(duì)HDR和獨(dú)立于DSB的精密編輯工具的探索。其成果是工程化學(xué)堿基編輯器的使用，當(dāng)僅有缺刻酶的Cas9融合到胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域時(shí)，允許有效C>T/G>堿基置換，后來(lái)變成腺苷脫氨酶，可以進(jìn)行反向A>G/T>C基變化[50,51]。堿基編輯的特點(diǎn)是，高效，插入缺失形成最小化以及DSB誘導(dǎo)最小化，但也有可能對(duì)近端，周圍堿基的意外修飾，以及無(wú)法創(chuàng)建正確的缺失插入突變或者是嘌呤到嘧啶、嘧啶到嘌呤的顛換。在克服這些缺點(diǎn)的另一個(gè)里程碑式努力中，將僅有nickase的Cas9與逆轉(zhuǎn)錄酶域和多功能的引物基本編輯導(dǎo)向RNA（PEGNA）結(jié)合起來(lái)，后者進(jìn)行目標(biāo)識(shí)別，同時(shí)作為反向轉(zhuǎn)錄的引物和模板。雖然目前的效率不如堿基編輯，但所產(chǎn)生的引物編輯技術(shù)比化學(xué)修改更為通用更為正確。不僅可以進(jìn)行所有 的12個(gè)可能的堿基對(duì)堿基的轉(zhuǎn)換之外，還允許創(chuàng)建小的正確的插入缺失突變[52]。除了堿基和引物編輯工具外，還通過(guò)將催化活性不活躍的核酸酶如死亡Cas9（dCas9）模塊化融合，建立了一系列表觀基因組編輯器，這些酶域包括表觀遺傳修飾物，如甲基酶或轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)。多種表觀遺傳修飾的組合甚至可以實(shí)現(xiàn)幾乎有效的可逆轉(zhuǎn)錄變化，可以在經(jīng)歷數(shù)百個(gè)有絲分裂而保持穩(wěn)定[53,54]。

迄今為止，基于DSB和不依賴DSB的編輯技術(shù)都已被證明能夠糾正包括HSC在內(nèi)的許多細(xì)胞類型的致病基因突變，目前需要克服平臺(tái)在安全性和有效性方面的特定不足。

2.2. HSC編輯臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素

以造血干細(xì)胞為編輯底物，可編程核酸酶的主要類別已被用作治療遺傳性血液病的治療工具（圖2）。所采用的策略依據(jù)所針對(duì)的疾病和所選擇的遞關(guān)方式可大致分為體外或體內(nèi)基因編輯方法。

通用基因編輯平臺(tái)的結(jié)構(gòu)、功能及基于HSC的應(yīng)用。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9是嵌合蛋白質(zhì)，其包含可定制的序列特異性DNA結(jié)合域（例如，鋅指ZF、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)蛋白TALEs或單導(dǎo)向RNA sgRNA）和介導(dǎo)DNA切割的非特異性核酸酶（例如：在ZFNs和TALENs中的FokI核酸酶和在CRISPR/Cas9中的Cas9）。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂主要通過(guò)兩種內(nèi)源性途徑修復(fù)：（1）易出錯(cuò)的非同源末端連接（NHEJ），它發(fā)生在整個(gè)細(xì)胞周期中，通過(guò)連接DNA末端來(lái)糾正斷裂；（2）通過(guò)正確的同源定向修復(fù)（HDR），在提供的供體模板存在下，例如，作為合成單鏈寡脫氧核糖核苷酸（ssODNs）、插入失活慢病毒載體（IDLV）或腺相關(guān)病毒6載體（AAV6）組分。堿基編輯器是由突變的核酸酶組成的嵌合蛋白質(zhì)，如Cas9-nickase（nCas9），一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，能夠使胞苷或腺嘌呤堿基脫氨以誘導(dǎo)堿基置換，和一個(gè)尿嘧啶糖苷酶抑制劑以防止堿基置換過(guò)程中的堿基切除修復(fù)。引物編輯器是一種嵌合蛋白，利用擴(kuò)展的gRNA，稱為引物編輯導(dǎo)向RNA（pegRNA）和融合到逆轉(zhuǎn)錄酶的nCas9，后者切割DNA，使側(cè)翼gRNA的pegRNA結(jié)合成為所需序列變化的pegRNA定向逆轉(zhuǎn)錄的引物。

歷史上，影響造血細(xì)胞系的遺傳性血液疾病，如血紅蛋白病、PIDs和儲(chǔ)存障礙，已通過(guò)體外處理HSC得到解決。而影響細(xì)胞外血蛋白的遺傳性血液疾病，如凝血因子缺乏癥和血友病，通過(guò)向肝細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)體內(nèi)交付來(lái)解決。直到最近，我們還看到了以HSC為基礎(chǔ)的體內(nèi)基因治療遺傳性血液病的努力，以減少治療相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)和死亡。圖3展示了體內(nèi)和體外HSC基因編輯的關(guān)鍵步驟。在分離和操作HSCs方面取得的進(jìn)展與成熟的HSCT方案相結(jié)合，有利于HSCs的體外修飾，這種修飾已經(jīng)在臨床上應(yīng)用于多種遺傳疾病。盡管有這些令人興奮的進(jìn)展，但為了使基于基因編輯的自體造血干細(xì)胞的治療充分發(fā)揮其潛力，仍然存在需要解決的主要障礙。相關(guān)因素包括：（i）來(lái)源：長(zhǎng)期再生HSC的來(lái)源和選擇；（ii）培養(yǎng)：為擴(kuò)增和編輯提供環(huán)境，同時(shí)保持HSC的‘干性’和高植入潛力，（iii）遞送：將編輯成分應(yīng)用于體外或體內(nèi)靶細(xì)胞/組織，以及（iv）案全性：避免、識(shí)別和消除重組事件和非靶細(xì)胞進(jìn)入和編輯事件，以及預(yù)防其他治療相關(guān)的并發(fā)癥。
圖3：

體外與體內(nèi)HSC基因編輯。所示的體外編輯步驟廣泛應(yīng)用于體內(nèi)動(dòng)物模型的基因編輯，現(xiàn)在也應(yīng)用于基因編輯的臨床試驗(yàn)?；蛱砑盈煼ǖ难芯拷Y(jié)果表明，基因編輯也可能受益于通過(guò)提供抗體-藥物結(jié)合物來(lái)選擇性去除HSC[55]，對(duì)于適當(dāng)?shù)募膊?，如FA，也可能受益于無(wú)預(yù)處理植入校正細(xì)胞[14]。顯示的體內(nèi)編輯步驟部分是針對(duì)HSC靶向基因添加方法的外推[56,57,58]，部分是基于基因編輯成分和mRNAs傳遞的最新進(jìn)展和理念[59,60,61,62]。

2.2.1. HSC的來(lái)源和分離

造血干細(xì)胞占成人骨髓細(xì)胞的比例不到0.1%，是一種罕見(jiàn)而脆弱的細(xì)胞群，通常存在于與細(xì)胞外基質(zhì)、成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞相連的特殊微環(huán)境中，這些微環(huán)境在很大程度上決定了它們的靜息狀態(tài)、自我更新或分化行為。HSC可以通過(guò)全身麻醉或局部麻醉下的多次骨髓穿刺來(lái)收集，或者在HSC從骨髓基質(zhì)強(qiáng)制分離（動(dòng)員）到外周血后通過(guò)白細(xì)胞清除來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前，經(jīng)過(guò)FDA批準(zhǔn)的臨床上可以使用的動(dòng)員劑有三種：造血生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）以及小型藥物趨化因子類似物普列沙福。一系列評(píng)估不同動(dòng)員劑在基于HSC的基因治療中的安全性和有效性的臨床試驗(yàn)表明，G-CSF和普列沙福的聯(lián)合應(yīng)用可以增強(qiáng)HSC的動(dòng)員和持續(xù)的體內(nèi)再增殖潛能[63,64,65,66]。或者，對(duì)于少數(shù)（5–10%）對(duì)一線方案反應(yīng)不佳的病例（5–10%），療效較差的GM-CSF可用作補(bǔ)救策略[67]。值得注意的是，收集用于臨床應(yīng)用的造血干細(xì)胞的一個(gè)主要問(wèn)題是某些疾病（如FA和其他骨髓衰竭綜合征）可獲得的細(xì)胞數(shù)量，其中造血干細(xì)胞的數(shù)量/質(zhì)量以及骨髓的成分顯著受損。為此，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）技術(shù)的發(fā)展[68]提供了另外一種患者來(lái)源細(xì)胞，許多研究小組將其作為基因靶向的可再生細(xì)胞來(lái)源加以利用。IPSC在生成HSC的潛在應(yīng)用在此不再贅述，但圍繞這一概念的廣泛希望和關(guān)注最近已在其他地方進(jìn)行了詳細(xì)論述[69]。

以表面標(biāo)記CD34、CD133、CD90、CD38、CD45RA為基礎(chǔ)的原始、長(zhǎng)期再生造血干細(xì)胞（LTR-HSC）的免疫表型特征已取得進(jìn)展，因此在人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，它們的定義不同，例如CD34+CD38−, CD34+CD90+、CD34+CD90+CD133+或CD34+CD90+CD45RA− 細(xì)胞[41,42,43,44,45,70,71]。然而，由于CD34+細(xì)胞在治療性HSC移植中的長(zhǎng)期成功經(jīng)驗(yàn)，祖細(xì)胞在移植后早期骨髓重建中的支持作用，具有高度特異性選擇方案的LTR-hsc的總產(chǎn)量顯著降低，臨床方案很大程度上依賴于CD34+的單標(biāo)記免疫磁性選擇[45,72]。唉，CD34+細(xì)胞群本身在很大程度上是異質(zhì)性的，只有一小部分細(xì)胞（1–3%）代表LTR HSC[16,73,74]，它們似乎位于CD34+CD38−細(xì)胞群中。CD34+CD380–6%的人群幾乎代表了所有短期和LTR-HSC潛能的總和[75]。然而，CD34-細(xì)胞對(duì)LTR-HSC池也有重要貢獻(xiàn)[76]。因此，對(duì)于所有LTR-hsc的明確的陽(yáng)性/陰性選擇方案，如全面大規(guī)模細(xì)胞分離所需，仍然是難以捉摸的，但具有關(guān)鍵的實(shí)際意義。高嵌合體和移植后快速重建依賴于高細(xì)胞產(chǎn)量，而特別是對(duì)于HSC的基因治療應(yīng)用，利用更純的細(xì)胞群將有助于降低成本并使治療更為廣泛，因?yàn)檩d體需求與暴露于載體的細(xì)胞數(shù)量大致成比例。在這種情況下，許多臨床試驗(yàn)證明了CD34+CD90+細(xì)胞的成功移植[70,71]，而一些研究表明，對(duì)于慢病毒基因的添加，分選高純度的CD34+CD38− 或者CD34+CD90+HSC可以減少培養(yǎng)體積，減少載體需求，顯著提高轉(zhuǎn)化效率[75,77,78]。在臨床應(yīng)用方面，開發(fā)基于免疫磁珠富集的良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）分級(jí)平臺(tái)，允許CD34+CD38-的富集和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，而在轉(zhuǎn)導(dǎo)后加入祖細(xì)胞CD34+CD38+細(xì)胞可以加速髓系重建[75]。優(yōu)化和采用這一或其他LTR-HSC選擇性系統(tǒng)以獲得特異而全面的LTR-HSC，降低載體成本，減少處理和培養(yǎng)時(shí)間，將極大地促進(jìn)基于HSC的基因編輯的臨床應(yīng)用。

2.2.2. 真LTR-HSCs的體外擴(kuò)增與編輯

HSCs的有效遺傳修飾需要HSCs的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增。然而，從天然支持性微環(huán)境中移除對(duì)脆弱的造血干細(xì)胞有負(fù)面影響。此外，在收集和免疫磁性富集后，來(lái)自骨髓或動(dòng)員的外周血的大多數(shù)CD34+細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)（細(xì)胞周期的G0/G1期）。這對(duì)依賴于修飾后細(xì)胞的擴(kuò)增或依賴于細(xì)胞周期的基因編輯策略提出了造成了的挑戰(zhàn)，例如HDR是與依賴與NHE相反的S/G2限制性的策略[79]。CD34+HSC的預(yù)激活促進(jìn)了細(xì)胞退出靜止?fàn)顟B(tài)以便進(jìn)行有效的基因修飾，而增加的刺激也與誘導(dǎo)分化和HSC長(zhǎng)期植入能力的損傷有關(guān)[77,80]，這將對(duì)臨床應(yīng)用產(chǎn)生可怕的后果。通過(guò)在免疫缺陷小鼠中植入修飾細(xì)胞的兩項(xiàng)示范性研究證明了這種植入和長(zhǎng)期再植入能力的降低，特別是基于HDR的修復(fù)，在小鼠骨髓中人類細(xì)胞的長(zhǎng)期（16周）修飾率與移植細(xì)胞中的初始修飾率進(jìn)行比較，NHEJ介導(dǎo)的編輯（55%?46%, 19.8%?3.3%比HDR介導(dǎo)的編輯（11.8%?2.3%, 17.3%?0.9%)更接近 [81,82]. 目前，基于無(wú)血清培養(yǎng)基（通常補(bǔ)充有重組造血生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如干細(xì)胞因子、FMS樣酪氨酸激酶3配體、血小板生成素、白細(xì)胞介素-3和白細(xì)胞介素-6）優(yōu)化的HSC體外培養(yǎng)和刺激條件，使造血干細(xì)胞增殖旺盛，但也逐漸分化。為了克服這一局限性，已投入大量精力建立新的培養(yǎng)和輸送方案，以提高HDR率，促進(jìn)HSC的體外擴(kuò)增，同時(shí)保留其“干細(xì)胞”特性，如文獻(xiàn)所述，最近通過(guò)抑制p53結(jié)合蛋白1增加了這一點(diǎn)[60,83，84,85]. 在過(guò)去幾年中，已經(jīng)研究了通過(guò)同步S/G2期細(xì)胞、通過(guò)誘導(dǎo)HDR成分或通過(guò)藥理或遺傳抑制NHEJ成分來(lái)改善HDR介導(dǎo)的基因編輯的策略[85,86,87,88,89]，包括不同類型HDR供體的適用性（見(jiàn)下文第2.2.3節(jié)）。同時(shí)，高通量篩選研究發(fā)現(xiàn)了一些小分子，如前列腺素E2（PGE2）、莖葉皂甙元1（SR1）和嘧啶吲哚衍生物UM171，它們能夠提高HSC的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，促進(jìn)HSC在體外的擴(kuò)增[77,90,91,92]。然而，這些化合物對(duì)造血干細(xì)胞長(zhǎng)期再生能力和多向分化潛能的影響仍有待進(jìn)一步研究。
 

2.2.3. 遞送——到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞和部位

基因編輯工具（包括編輯器和任何外源性同源供體修復(fù)模板）高效、無(wú)毒地導(dǎo)入HSC是基因編輯HSC臨床應(yīng)用的長(zhǎng)期挑戰(zhàn)之一。

盡管編輯器可以以多種不同的形式進(jìn)行遞送，但基于HDR的方法HSC基因編輯依賴于供體DNA修復(fù)模板在編輯過(guò)程中的共同傳遞和存在，如通?；瘜W(xué)修飾的ssODN、單鏈DNA（ssDNA）病毒基因組，或者用于長(zhǎng)靶向插入的雙鏈DNA分子。不同的供體利用不同的修復(fù)途徑，具有不同的毒性水平和編輯精度，由于原始HSC對(duì)該操作過(guò)程的頑固性和敏感性，優(yōu)化修復(fù)途徑尤其對(duì)臨床應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)[42,93,94]。

多年來(lái)，開發(fā)了多種非病毒和非整合的病毒傳遞系統(tǒng)，用于體內(nèi)或體外核酸酶的傳遞，包括質(zhì)粒DNA、體外轉(zhuǎn)錄RNA、TALEN/ZFN蛋白或CRISPR/Cas核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）等非病毒載體，整合酶缺陷型LV（IDLV）、腺病毒（AdV）和腺病毒相關(guān)病毒（AAV）作為病毒載體。每種系統(tǒng)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。利用攜帶核酸酶和供體模板的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電穿孔是編輯HSCs最廉價(jià)、應(yīng)用最廣泛的方法。然而，HSC的毒性、質(zhì)粒細(xì)菌DNA的骨架以及由于核酸酶表達(dá)盒可能隨機(jī)整合到宿主基因組中而導(dǎo)致的遺傳毒性的固有風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂，使其僅限于用于原理性研究[95,96]。考慮到基因編輯系統(tǒng)在靶細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)時(shí)間和濃度是決定靶向和非靶向DNA切割的關(guān)鍵因素，通常主要目標(biāo)是采用“命中-逃逸”方法，包括在靶細(xì)胞內(nèi)瞬間高表達(dá)核酸酶。為此，體外轉(zhuǎn)錄的mRNA或編碼核酸酶的gRNA/mRNA和供體模板的核轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染已成為HSC基因編輯的先進(jìn)遞送形式，多項(xiàng)研究表明，此方法具有高轉(zhuǎn)染效率和最低細(xì)胞毒性[97,98,99]。體外轉(zhuǎn)錄mRNA的瞬時(shí)和強(qiáng)大的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)將潛在的非靶向插入或突變風(fēng)險(xiǎn)降至最低，同時(shí)一些研究進(jìn)一步研究了（下調(diào)）正確編輯的編輯時(shí)間窗口的方法[100,101,102]。相反，對(duì)于某些應(yīng)用，mRNA的短半衰期可能是一個(gè)限制因素[103]。因此，一些研究小組致力于修改體外轉(zhuǎn)錄的mRNA的結(jié)構(gòu)元件，特別是通過(guò)加入抗逆轉(zhuǎn)帽類似物、聚（a）尾和含有調(diào)控元件的5′和3′UTRs來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和翻譯效率[104]。最近，Wesselhoeft及其同事報(bào)告說(shuō)，環(huán)狀RNA提高了RNA的穩(wěn)定性，并與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量和穩(wěn)定性的提高有關(guān)[105]。就像體外轉(zhuǎn)錄的TALEN和ZFN的mRNA或CRISPR/Cas的mRNA/gRNA一樣，預(yù)組裝的CRISPR/Cas核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物是HSC基因編輯的高效載體，允許在體外更可控和瞬時(shí)地傳遞核酸酶活性[106107108]。因此RNP電穿孔發(fā)展成為HSC體外修飾的一種選擇方法時(shí)，HSC的體內(nèi)遞送作為一個(gè)新興的關(guān)注領(lǐng)域在使用純化的核酸酶時(shí)提出了一些技術(shù)挑戰(zhàn)。Cas9蛋白的大尺寸和正電荷阻礙了其在體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)傳遞，而Cas9蛋白在體內(nèi)的暴露又可能引起細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。事實(shí)上，鑒于CRISPR/Cas的微生物來(lái)源，在79%和65%的人類血清中分別檢測(cè)到來(lái)自金黃色葡萄球菌（SaCas9）和化膿性鏈球菌（SpCas9）的Cas9抗體并不奇怪[109]，這對(duì)編輯效率的影響需要降低到最低。為此，減少核酸酶降解和宿主潛在免疫反應(yīng)的脂質(zhì)或金納米顆粒已被用于體內(nèi)基因編輯，盡管在造血干細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的基因編輯率不足以治療大多數(shù)造血疾病[110111]。此外，許多非整合病毒載體，如IDLVs和AAVs等，對(duì)hsc具有高度的趨化性，已被用于基因編輯成分的傳遞。非整合型AAV病毒載體（尤其是rAAV6）由于其在非分裂細(xì)胞（如HSCs）中的高轉(zhuǎn)導(dǎo)率和非致病性行為而成為一種很有前途的核酸酶?jìng)鬟f系統(tǒng)，使其成為體內(nèi)和潛在治療應(yīng)用的理想載體。然而，它有限的包裝容量低于4.8kb，這使得它不適合像TALENs和許多Cas9變體這樣的大型核酸酶。為了解決這一局限性，Bak等人最近開發(fā)了一種雙AAV6供體載體系統(tǒng)（具有6.5 kb的包裝容量），該系統(tǒng)能夠有效地靶向T細(xì)胞和造血干細(xì)胞而毒性很低[112113]。IDLVs甚至整合LVs，由于其大于10kb的載量，已被廣泛用于核酸酶和供體DNA模板的傳遞，用于篩選文庫(kù)等研究性應(yīng)用，IDLVs也被提出用于臨床應(yīng)用。然而，AAV-和IDLV-衍生的單鏈DNA在靶組織中保留很長(zhǎng)時(shí)間[114115]，因此存在持續(xù)基因組修飾和外源DNA錯(cuò)誤整合的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2.4. 安全性：避免靶細(xì)胞和部位失去目標(biāo)及臨床實(shí)驗(yàn)中的其他未知因素

基因編輯產(chǎn)品的質(zhì)量可以受到上述三個(gè)因素中的任何一個(gè)，即來(lái)源、培養(yǎng)和交付的次優(yōu)選擇的限制。需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床前研究，以確定確保每種疾病的基因編輯產(chǎn)品的治療效益所需的長(zhǎng)期安全性、持續(xù)性和最佳校正水平，同時(shí)將細(xì)胞毒性和潛在的靶外活性保持在最低水平。

與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，基因編輯平臺(tái)消除了病毒載體近隨機(jī)整合的需要，從而最小化插入性遺傳毒性的風(fēng)險(xiǎn)。然而，監(jiān)測(cè)可編程核酸酶的活性和特異性仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)?；蚓庉嫷腍SC治療潛力最大的擔(dān)心之一是在與預(yù)定目標(biāo)具有實(shí)質(zhì)序列相似性的位點(diǎn)引入不需要的非目標(biāo)基因組修飾[48]?；贒SB甚至HDR介導(dǎo)的基因編輯固有的另一個(gè)擔(dān)心是，由于意外地使用替代修復(fù)途徑（例如基于NHEJ的修復(fù)）而引入在靶標(biāo)上進(jìn)行的插入缺失或重組事件，這可能導(dǎo)致潛在的插入缺失，或者在某些情況下可能引發(fā)潛在的致癌易位突變。已觀察到四種主要可編程核酸酶中的每一種都存在非目標(biāo)活性[116171118119]。為了評(píng)估和幫助最小化目標(biāo)外活動(dòng)和相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，開發(fā)了越來(lái)越多的分析方法，以確定目標(biāo)外事件的分布和頻率，包括基于序列同源性和計(jì)算算法的硅工具方法、離體方法（CIRCLE-Seq，Digenome-seq和SITE-seq）和基于細(xì)胞的分析方法（GUIDE-seq、BLESS/Blis和HTGTS）[120]。GUIDE-seq和Digenome-seq被認(rèn)為是迄今為止最敏感的全基因組方法；然而，沒(méi)有一種方法被證明適合于臨床試驗(yàn)[121]。染色體重排評(píng)估方法目前才出現(xiàn)[48,49]，CAST-Seq甚至允許定量評(píng)估，盡管僅限于預(yù)測(cè)的on-to-off靶位點(diǎn)之間的重組事件[122]。 

堿基和引物編輯作為不依賴于DSB的編輯策略有助于降低甚至消除DSB介導(dǎo)的遺傳毒性事件的內(nèi)在風(fēng)險(xiǎn)。此外，減少編輯分子脫靶活性的策略有助于減少因疏忽而產(chǎn)生的插入缺失和重組事件，這也適用于DSB依賴的編輯。發(fā)表了大量限制脫靶的策略，除了對(duì)編輯工具的有限接觸外，還包括但不限于在ZFN和TALEN中使用專性異二聚體FokI，使用nickase-Cas9二聚體分子，建立更嚴(yán)格的PAM序列，高保真Cas版本中非特異性DNA相互作用的去除，CRISPR/Cas sgRNAs的截?cái)?、延伸或泡狀發(fā)夾修飾[40，123，124]

盡管有大量的研究小組正在致力于上述四個(gè)領(lǐng)域的進(jìn)一步技術(shù)開發(fā)，但HSC編輯的臨床前和臨床應(yīng)用進(jìn)展迅速。這尤其得益于臨床前和臨床試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，這些經(jīng)驗(yàn)來(lái)自于有關(guān)HSC來(lái)源和培養(yǎng)的基因添加方法，部分基于有效的體外RNP傳遞，結(jié)合飽和脫靶分析，以應(yīng)對(duì)編輯最緊迫的安全問(wèn)題。

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