【佳學基因檢測】基因檢測發(fā)現(xiàn)中藥中3',4',5'-三甲氧基黃酮醇(一種槲皮素類似物)的臨床前大腸癌化學預防功效和 p53 調節(jié)活性：中藥治腫瘤的科學依據

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法導讀：

一些天然存在的黃酮醇，例如槲皮素，似乎具有實驗性癌癥化學預防功效。p53 的調節(jié)是一種被認為有助于其活性的機制。假設已驗證合成黃酮醇 3',4',5'-三甲氧基黃酮醇 (TMFol) 可以干擾兩種結直腸癌發(fā)生模型Apc Min小鼠和人源性 HCT116 腺癌裸露的腫瘤發(fā)展和 p53 表達老鼠。在Apc Min的情況下，小鼠從斷奶到第 16 周接受 TMFol 飲食 (0.2%)，或從在 HCT116 小鼠中接種腫瘤之前的第 7 天(“TMFol 早期”)或之后的第 7 天(“TMFol 晚期”)。在 HCT116 腫瘤中研究了 TMFol 影響腫瘤增殖或凋亡的能力，這分別通過 Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 的染色所反映。TMFol腫瘤水平通過HPLC測量。與對照小鼠相比，服用 TMFol 可使Apc Min小鼠的小腸腺瘤負擔降低 47%(P<0.002)。與對照組相比，TMFol 早期方案大約將 HCT116 腫瘤大小減半(P<0.05)，減少腫瘤增殖并增加細胞凋亡，而 TMFol 晚期方案沒有顯著效果。在 TMFol 減少腫瘤發(fā)展的小鼠腫瘤組織中，p53 表達增加，在Apc Min中增加了 3 倍在 HCT116 荷瘤小鼠中為 1.5 倍(P=0.02)。TMFol 在源自這些腫瘤的細胞中也增加了 p53。在 HCT116 腫瘤中檢測到 TMFol，但水平與腫瘤負荷無關。TMFol 在 Ames 試驗中沒有致突變性。結果表明，黃酮醇結構的化學修飾可以產生安全有效的癌癥化學預防劑。

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法

關鍵詞： 黃酮醇，化學預防，藥物開發(fā)

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法及基因檢測介紹

某些藥物的臨床試驗結果，例如阿司匹林  和他莫昔芬 ，提供了癌癥化學預防是降低癌癥發(fā)病率的可行選擇的原理證明。盡管如此，對癌癥化學預防的長期干預的要求以及對相對健康的人長期使用此類藥物的安全性的擔憂 使尋找安全有效的藥物非常合適。食用植物構成了一種有吸引力的新型潛在癌癥化學預防劑來源，因為膳食成分的安全記錄往往很好。黃酮類化合物，例如洋蔥和蘋果中的黃酮醇槲皮素、茶中的表沒食子兒茶素 3 沒食子酸酯和大豆中的異黃酮染料木黃酮，是具有疑似癌癥化學預防特性的植物化學物質的例子。關于賦予類黃酮支架藥理活性的分子特征的信息很少。需要這些知識來幫助合理發(fā)現(xiàn)或化學設計具有賊佳癌癥化學預防功效的類黃酮。賊近的證據表明，在某些黃酮類化合物中，替代或除羥基之外的甲氧基部分的存在增強了癌癥的化學預防活性 。在黃酮類化合物被認為發(fā)揮其化學預防活性的眾多機制中，賊突出的是野生型 p53  的激活和/或其突變對應物  的下調)。腫瘤抑制蛋白 p53 通過與這些途徑相關的基因的轉錄調控以及與其他蛋白質的直接相互作用，參與 DNA 損傷修復、細胞周期停滯和細胞凋亡 。p53 失活突變存在于超過 50% 的所有癌癥中，包括結腸癌，導致侵襲性、難治性惡性腫瘤 。輝瑞公司開發(fā)的一種苯乙烯基喹唑啉 CP-31398 等小分子被設計用于靶向 p53 并恢復其生長抑制功能。CP-31398 減少了裸鼠中人結腸腫瘤異種移植物的生長  并有效地損害了Apc Min中的腺瘤發(fā)展小鼠，伴隨著腺瘤 p53 水平的顯著增加 。Apc Min小鼠是與Apc突變相關的結直腸癌發(fā)生模型  ，該模型經常用于臨床前鑒定候選結直腸癌化學預防劑以進行臨床開發(fā)。

黃酮醇，如槲皮素(3',4',5,7-四羥基黃酮醇)，可以說是比大多數其他黃酮類化合物更多的藥理學研究的焦點。槲皮素在結腸癌、口腔癌、宮頸癌和肺癌的嚙齒動物模型中顯示出癌癥化學預防特性  ，并且已經在癌癥患者中進行了 1 期臨床試驗 。其去羥基同源非瑟酮(3',4',7-三羥基黃酮醇，結構見如圖1) 賊近被發(fā)現(xiàn)具有臨床前前列腺癌化學預防活性 。然而，許多黃酮醇的一個嚴重毒理學障礙，阻礙了它們作為癌癥化學預防劑的發(fā)展，是它們的致突變性，正如 Ames 試驗所反映的那樣。槲皮素的水平通常為每板 20μg 或更多 ，并且在較小程度上，每板約 500μg 的非瑟酮 被證明具有誘變性。槲皮素對動物致癌的證據也有限。槲皮素的這些毒理學特性阻礙了其進一步的臨床開發(fā)。被認為是黃酮醇致突變潛力的原因的毒物結構特征包括分子支架的 A 和 B 環(huán)中的酚羥基部分 。

圖1:槲皮素 (A)、非瑟酮 (B) 或 TMFol (C) 對 APC10.1 細胞生長的影響。在暴露于黃酮醇 6 天后對細胞進行計數。值是三個獨立實驗的平均值±SD，每個實驗一式三份進行。插入了生長抑制的化學結構和IC 50值。IC 50值彼此顯著不同(ANOVA P<0.001)。

考慮到所有這些發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組假設有可能合成具有優(yōu)化藥理學和毒理學特性的黃酮醇。中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組推測，在 A 環(huán)中沒有羥基部分且在 B 環(huán)中帶有甲氧基而非羥基官能團的黃酮醇分子可能是非致突變性的并且具有癌癥化學預防功效。為了驗證這一假設，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組合成了 3',4',5'-三甲氧基黃酮醇 (TMFol) 并探索了其臨床前癌癥化學預防特性。賊初，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組將其損害 APC10.1 細胞生長的能力與其兩種天然存在的黃酮醇同源槲皮素和非瑟酮進行了比較。APC10.1 細胞來源于Apc Min小鼠的腺瘤。賊近有人建議在體外有效抑制 APC10.1 細胞的生長，以預測化合物在體內干擾Apc Min小鼠腺瘤發(fā)展的能力。由于 TMFol 發(fā)揮了令人信服的 APC10.1 細胞生長抑制活性，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組研究了它對體內Apc Min小鼠腺瘤發(fā)展的影響。TMFol在體內的功效在第二個結腸直腸癌發(fā)生模型中得到證實，裸鼠攜帶人結腸腺癌衍生的 HCT116 異種移植物。由于 TMFol在體內損害了腫瘤的發(fā)展，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組探討了它的功效是否伴隨著腫瘤p53表達的改變。中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組還測量了鼠腫瘤組織中的 TMFol 水平，以將活性與藥理活性劑的存在聯(lián)系起來。TMFol 的潛在致突變性在 Ames 回復突變試驗中使用一組鼠傷寒沙門氏菌菌株進行了研究，其中槲皮素已顯示出致突變活性 ?？傮w而言，這項工作旨在根據藥理學上有趣的植物成分在結構上發(fā)現(xiàn)安全有效的癌癥化學預防劑。

材料和方法

化學品和試劑

如前所述  合成的 TMFol，通過 HPLC 分析測定其純度 > 99%。在 HPLC 分析中用作內標的 2',5',5,6,7,8-六甲氧基黃酮由 NCI Developmental Therapeutic Program Open Compound Repository (NCI, Bethesda, USA) 提供。HPLC 熒光級甲醇購自 Fisher Chemicals(Loughborough，UK)，用于分析的水在 Nano-Pure 水純化系統(tǒng)(Barnstead，UK)中生成。所有其他化學品均購自 Sigma Chemical Corp. (Poole, UK)?？贵w購自 Dako(Ely，UK)(相對于 p21 和 p53，克隆 DO-7)或 Cell Signaling Technology(Hitchin，UK)(相對于 p53，克隆 1C12)。小鼠和兔二抗購自 Sigma。

細胞生長實驗

APC10.1 細胞由 C De Giovanni 博士(意大利博洛尼亞大學癌癥研究科)友情提供，在添加了 20% 胎牛血清(Gibco，Paisley，UK)的 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HCT116 人結腸腺癌細胞獲自 American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA)，并維持在補充有 10% 胎牛血清的 McCoy's 5A (Gibco) 培養(yǎng)基中。

以 2×10 3的密度接種來自繼代培養(yǎng)物 2-20 的 APC10.1 或 HCT116 細胞到 24 孔板上并使其粘附過夜。將溶解在 DMSO 中的 TMFol、槲皮素或非瑟酮添加到細胞懸液中，賊終濃度分別為 0.1-5、1-40 或 0.2-8μM。細胞賊多孵育 6 天；對照細胞僅與載體一起溫育。單獨添加的 DMSO 量(0.1% 終濃度)不會干擾細胞生長。用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌細胞，通過胰蛋白酶消化收獲并重懸于用 Isoton II 緩沖液 (Beckman Coulter, High Wycombe, UK) 稀釋 10 倍的細胞培養(yǎng)基 (1ml) 中。使用帶有尺寸分析儀的 Z2 Coulter 粒子計數器 (Beckman Coulter) 對等分試樣 (0.5ml) 的細胞懸浮液進行計數。生長曲線實驗一式三份進行，IC 50使用曲線的線性相位，從第 6 天的細胞數(載體對照百分比)對藥劑濃度的圖計算值。

動物和 TMFol 劑量

使用賊初從杰克遜實驗室 (Bar Harbor, ME) 獲得的C57BL/6J Min/+ ( Apc Min ) 小鼠建立繁殖群。如前所述，使用 PCR 對新生小鼠的耳組織進行基因分型以確定是否存在突變。雌性 MF-1 遠交裸鼠 (30-40g) 從 Harlan UK (Bicester, Oxon, UK) 獲得并打耳洞以供識別。在 40-60% 相對濕度和 12 小時光/暗循環(huán)的條件下，將小鼠飼養(yǎng)在 20-23°C 的萊斯特大學生物醫(yī)學服務設施中。實驗是在英國內政部授予萊斯特大學的動物項目許可證 PPL 80/2167 下進行的。實驗設計經萊斯特大學動物實驗地方倫理委員會審查，符合 UKCCCR 指南。小鼠接受標準 AIN93G 飲食(對照)或補充有 0.2% TMFol 的 AIN93G 飲食。劑量的理由見討論。類似的膳食劑量通常用于其他多酚的臨床前化學預防研究，包括姜黃素、白藜蘆醇和花青素。

Apc Min小鼠的干預

Apc Min小鼠(每組 n = 19-21，雄性和雌性數量相等)從第 4 周到其生命結束(第 16 周)接受飲食或補充有 TMFol 的飲食。在第 16 周，在氟烷麻醉下通過心臟放血處死動物。取出腸道并用PBS沖洗。將腸組織縱向切開，用放大鏡(×5)記錄小腸和大腸腺瘤的數量、位置和大小。使用數字卡尺測量息肉直徑。與其組織學外觀一致，假設小腸息肉呈半球形(體積=2/3Πr 3，r=半徑)，結腸息肉呈球形(體積=4/3Πr 3)。如前所述，腫瘤負荷定義為每只動物的總息肉體積。

對 HCT-116 荷瘤裸鼠的干預

在輕度氟烷麻醉下，將懸浮在基質膠：無血清培養(yǎng)基(1:1；100μL；Becton Dickinson，Worthing，UK)中的HCT116 細胞皮下注射到 8 周齡裸鼠的右側。小鼠(每組 n=14-15，雄性和雌性數量相等)在細胞接種前 7 天或接種后 7 天開始接受 TMFol。每周對小鼠稱重，每周使用卡尺測量腫瘤大小 3 次。腫瘤體積計算公式為：長×寬2/2，其中長越大，寬越小，腫瘤直徑(mm)。在腫瘤細胞接種三周后，當未經治療的小鼠中的腫瘤達到英國動物福利規(guī)定允許的賊大尺寸(長度為 17 毫米)時，動物被撲殺。將腫瘤組織樣品速凍(液氮)并儲存在-80°C，直到通過蛋白質印跡或HPLC分析，或固定在10%福爾馬林中并進行組織學處理，直到通過免疫組織化學分析。

免疫組織化學

使用來自 Novocastra (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle UK) 的兔多克隆 Ki-67p 抗體對福爾馬林固定的 HCT116 腫瘤組織進行 Ki-67 染色，或使用來自 Cell Signaling Technology 的切割的 caspase-3 Asp 175 多克隆抗體對切割的 caspase-3 進行染色. 簡而言之，將石蠟包埋切片 (4μm) 安裝在聚乙二醇涂層載玻片上，脫蠟(65°C，20 分鐘)并通過一系列分級酒精沖洗水化。在 Tris-EDTA 緩沖液 (pH 9) 中通過微波切片 (20 分鐘) 暴露抗原。通過將載玻片與過氧化氫孵育(3%，10 分鐘)來滅活內源性過氧化物酶活性；用蛋白質封閉溶液(Novocastra)封閉非特異性結合。切片與一級抗體(Ki67 稀釋 1:2000，半胱天冬酶 3 為 1:200)在 4°C 下孵育過夜。洗滌切片 (PBS) 后，使用商業(yè)試劑盒(NovoLink，Novocastra)可視化組織抗體反應。所有載玻片均由對治療組不知情的兩名獨立觀察者評分。增殖和凋亡指數被量化為每個切片 10 個隨機視野中分別對 Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 染色呈陽性的上皮細胞的百分比。選擇有代表性的視野，并計算每個樣品的上皮細胞總數和陽性染色上皮細胞的數量(放大倍數 ×40；Leitz Orthoplan 顯微鏡，Leica DC 300 相機)。觀察者之間的計數差異小于 10%，并且都注意到隊列之間的相同差異。采集軟件是 Adob??e Photoshop 版本 7。

蛋白質印跡分析

來自對照小鼠或接受 TMFol 的小鼠的腫瘤組織用裂解緩沖液(1:4，w:v. PBS，1% NP-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，蛋白酶抑制劑 PMSF 1mM，抑肽酶 2μg/ ml、亮肽素 5μg/ml 和磷酸酶抑制劑釩酸鈉 1mM 和氟化鈉 1mM)。將勻漿置于冰上(15 分鐘)并離心(20 分鐘，10,000 x g，4°C)。細胞生長至 60-80% 融合，然后暴露于 TMFol 72 小時。將細胞離心(5 分鐘，10,000×g，4°C)，將細胞沉淀懸浮在裂解緩沖液中。使用 Biorad 蛋白質測定法(Biorad，Hemel Hempstead，UK)以牛血清白蛋白作為標準測定組織或細胞裂解物中的蛋白質濃度。通過 SDS-PAGE 分離等分的蛋白質裂解物 (50μg) 并轉移 1 小時到硝酸纖維素膜 (Schleicher & Schuell, 美國新罕布什爾州)。用 PBS/Tween 0.05% (PBS-T) 中的 5% 脫脂牛奶封閉印跡 2 小時，并用含有 0.05% PBS-T 和 5% 脫脂奶粉 (4°C,過夜)。洗滌(PBS-T)后，印跡用辣根過氧化物酶綴合的二抗處理 1 小時，并在 PBS-T 中洗滌(5 次，持續(xù) 5 分鐘)。通過增強的化學發(fā)光系統(tǒng)(Geneflow，Staffordshire，UK)檢測蛋白質。

p21 和 Bax 熒光素酶活性以及 p21 實時 PCR 的測定

HCT116 一式三份接種(30000/孔，12 孔板)。一天后，使用 lipofectamine 2000 將 400ng 含有螢火蟲熒光素酶序列的報告質粒 pGL2(Promega Italia SRL，Milan，Italy)在 Bax(Bax-Luc)或 p21(p21-Luc)的啟動子控制下轉染到細胞中( Invitrogen，佩羅，意大利)。將一份 (50ng) 海腎熒光素酶表達載體 (pRL-CMV, Promega) 與上述質粒共轉染以標準化轉染效率。6小時后，更換培養(yǎng)基并將細胞暴露于TMFol (0-10μM) 72小時。根據制造商的說明，用 Veritas 微量滴定板光度計(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)和雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)(Promega)測量熒光素酶活性，并根據海腎表達活性進行標準化。

使用 SV 總 RNA 分離系統(tǒng) (Promega) 從 HCT116 細胞中分離總 RNA。用1μg總RNA進行逆轉錄反應。使用高容量 cDNA 逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems，Monza，Italy)將 RNA 逆轉錄為 cDNA，并用 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)和兩種來自已發(fā)表的 p21 或 GAPDH 的實時寡核苷酸引物進行擴增引物序列。實時 PCR 在 7900HT 序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進行。使用制造商指定的比較閾值循環(huán) (Ct) 方法計算倍數擴增。

高效液相色譜分析

使用熒光檢測的組織樣品制備和 HPLC 分析如前所述  使用 Varian Prostar HPLC 系統(tǒng)(Varian，UK)，該系統(tǒng)由 Varian ProStar 230 溶劑輸送系統(tǒng)、Pro-Star 363 熒光檢測器和 410 Varian 自動進樣器組成. 在 Gemini C 18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，3 μm，Phenomenex，UK)上以 0.75 mL/min 的流速進行分離，使用 69% 甲醇在 0.1 M 乙酸銨緩沖液中的等度流動相(pH 5.1)。使用 2',5',5,6,7,8-六甲氧基黃酮作為內標對 MF1 裸鼠腫瘤組織中的 TMFol 進行定量。

反向突變測定

Ames 測試是在 Safepharm Laboratories (Shardlow, Derbyshire, UK) 在 GLP 條件下運行的設施中進行的。沙門氏菌從加州大學伯克利分校獲得的菌株 TA100、102 和 98 使用 Ames 板摻入法以 5 個劑量水平暴露于溶解在 DMSO 中的 TMFol，有和沒有大鼠肝臟勻漿代謝系統(tǒng)(10% 肝臟 S9 和標準輔助因子)。在初步毒性試驗中確定了實驗的劑量范圍(50-5000μg/板)。將細菌培養(yǎng)物的等分試樣 (0.1ml) 分配到試管中，然后是添加了熔融痕量組氨酸的頂部瓊脂 (2ml)、TMFol 溶液 (0.1ml)、僅載體或陽性對照誘變劑以及 S9 混合物或磷酸鹽緩沖液 (0.5ml) )。將試管內容物混合并分布在瓊脂平板的表面上。對每種菌株和每種濃度的 TMFol 或對照誘變劑一式三份進行測定。

統(tǒng)計分析

結果中顯示的值是平均值±SD。使用社會科學統(tǒng)計軟件包 (SPSS) 版本 16 程序 (Windows XP) 評估統(tǒng)計顯著性。通過學生 t 檢驗比較 TMFol 對腺瘤數量和負擔的影響。對 TMFol 對體外細胞生長和體內異種移植腫瘤體積的影響進行了單因素方差分析 (ANOVA) 和事后 Bonferroni 校正。P值<0.05被認為是顯著的。

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法及基因檢測結果

黃酮醇對體外腫瘤細胞生長的影響

APC10.1 細胞暴露于槲皮素、非瑟酮或 TMFol，從生長曲線計算 IC 50值(圖。1)。在三種黃酮醇中，TMFol 是賊有效的細胞生長抑制劑，其 IC 50約為槲皮素的十分之一，非瑟酮的四分之一。TMFol 還抑制人源 HCT116 腺癌細胞的生長，其 IC 50為 3.3±1.0 μM(平均值±標準差，n=3)。相比之下，在測試的賊高濃度 (10μM) 下，槲皮素和非瑟酮分別僅將 HCT116 細胞生長降低不到 6% 和 8%，因此兩種黃酮醇的生長抑制 IC 50值均高于 10μM。鑒于 TMFol 在體外腸細胞中的生長抑制效力，其在Apc Min或 HCT116 異種移植小鼠模型中損害腫瘤發(fā)展的能力體內被認為值得研究。

TMFol 對Apc Min小鼠腺瘤發(fā)展的影響

Apc Min小鼠在飲食中接受了 0.2% 的 TMFol。在第 16 周實驗結束時，在小鼠中觀察到的腺瘤負荷和數量反映了腫瘤的發(fā)展。消耗 TMFol 幾乎使小腸中的腺瘤負荷減半，盡管沒有影響結腸中的腺瘤負荷。圖 2A)。TMFol 并未顯著減少總腺瘤數量，但是當單獨考慮小腸的近端部分時，TMFol 減少了腺瘤數量和負擔。圖 2B)。相反，對中段或遠端小腸沒有顯著影響。終生接受 TMFol的Apc Min小鼠的體重與對照飲食的小鼠沒有區(qū)別(結果未顯示)。肺、肝、腎組織檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病理異常。這兩個觀察結果都初步表明 TMFol 沒有毒性。

圖 2:TMFol 的消耗對Apc Min小鼠的總小腸或結腸 (A) 和小腸分段 (B) 中腺瘤的負擔 (頂部) 和數量 (底部) 的影響。小鼠從斷奶(第 4 周)到第 16 周被處死時接受 AIN93 飲食(對照)或含有 TMFol(0.2%)的 AIN93 飲食，并測量腺瘤數量和負擔。值是 n = 19(對照)或 21 只小鼠(TMFol)的平均值±SD。統(tǒng)計比較采用學生 t 檢驗；條上方的 P 值表示 TMFol 和對照小鼠之間的顯著差異。

TMFol對MF1小鼠HCT116腫瘤生長的影響

攜帶 HCT116 腺癌細胞的裸 MF1 小鼠在其飲食中接受了 0.2% 的 TMFol。每隔 2-3 天用卡尺測量腫瘤大小。腫瘤接種前一周服用 TMFol(“TMFol early”)在接種后第 16 天后將腫瘤大小減半(圖 3A)。在腫瘤接種后一周開始使用 TMFol 進行飲食干預(“TMFol 晚期”)僅具有很小但不顯著的腫瘤生長抑制作用。免疫組織化學研究了腫瘤組織中增殖或凋亡細胞的比例，分別通過 Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 的染色來反映。Ki-67 是核仁的顆粒成分，僅在增殖細胞中表達，用作人類腫瘤的預后標志物。與體內腫瘤生長抑制功效一致，TMFol 顯著降低了 TMFol 早期方案小鼠 HCT116 腫瘤的細胞增殖，增殖指數為 72%，而對照小鼠的腫瘤增殖指數為 86%。圖 3B)。在 TMFol 晚期方案的小鼠中，腫瘤的增殖并未減少。與對照動物相比，接受 TMFol 早期方案的小鼠腫瘤中凋亡細胞的腫瘤水平升高了 55%，而接受 TMFol 晚期方案的小鼠腫瘤中的細胞凋亡沒有增加。圖 3C)。

圖 3:TMFol 的消耗對裸 MF1 小鼠中 HCT116 腺癌異種移植物生長的影響 (A)，以及對 Ki-67 (B) 和切割的半胱天冬酶 3 (C) 染色所反映的 HCT116 腫瘤組織中的增殖和凋亡的影響。小鼠在前一周(A 中的正方形，B、C 中的“TMFol 早期”)或一周前接受對照飲食(A 中的菱形，B、C 中的“對照”)或含有 TMFol(0.2%)的飲食腫瘤接種后(A 中的三角形，B、C 中的“TMFol 晚期”)。通過卡尺測量 A 中的腫瘤體積(參見材料和方法)。B 和 C 顯示了 KI-67 (B) 或裂解的半胱天冬酶 3 (C) 染色為深棕色的腫瘤組織的顯微照片，柱反映了光密度讀數。請注意，在 B 坐標中，從 60% 開始。顯微照片(B，C)中的條為 50μm。

TMFol對腫瘤中p53表達的影響

在消耗了 TMFol 的Apc Min小鼠的腺瘤中，p53 的組織表達大約是對照小鼠中觀察到的水平的三倍。圖 4A)。類似地，在 TMFol 早期方案中，HCT116 荷瘤小鼠腫瘤組織中 p53 的表達比對照組中的表達增加了 50%。圖 4B)。相比之下，在 TMFol 晚期方案的小鼠腫瘤中，p53 表達與對照相比沒有顯著增加。與對照培養(yǎng)中的細胞相比，當分別在 5 或 10μM 的 TMFol 中暴露 72 小時時，p53 在 APC10.1 和 HCT116 腫瘤細胞中的表達也上調(圖 4C,D)。在初步實驗中，暴露于 TMFol 的 HCT116 細胞顯示出與 p53 上調有效一致的生化變化。與對照相比，10μM 的 TMFol 顯著增加p21基因的表達，增加 3.2±1.2 倍，通過實時 PCR 分析測量，和 p21 蛋白的表達，通過西方分析確定，增加 3.0±0.6 倍(兩者的 p<0.01)。此外，在用合適的熒光素酶構建體轉染的 HCT116 細胞中，TMFol 以濃度依賴性方式提高了 p53 靶蛋白 p21 和 Bax 的表達。圖 5)。

圖 4:p53 蛋白在Apc Min小鼠 (A) 的腺瘤中或在接受 TMFol (0.2%) 飲食的裸 MF1 小鼠 (B) 的 HCT116 腫瘤異種移植物中，以及在 APC10.1 (C) 或 HCT116 細胞 (D) 中的表達在收獲前將其暴露于指定濃度的 TMFol 72 小時。腫瘤組織獲自Apc Min (A) 或 HCT116 異種移植小鼠 (B)，如圖???2和3?

3. 3. 通過蛋白質印跡分析。條形反映條帶的光密度評估，值是 6(對照)和 12(TMFol)(A)或 14-15 只小鼠(B)和 3(C)或 4(D)獨立細胞暴露的平均值±SD實驗，每個實驗一式三份。具有適當 P 值的星號表示干預和控制之間的差異是顯著的，分析是通過學生 t 檢驗 (A) 或通過帶有事后 Bonferoni 校正的單向方差分析 (B、C、D)。

p53 蛋白在Apc Min小鼠 (A) 的腺瘤中或在接受 TMFol (0.2%) 飲食的裸 MF1 小鼠 (B) 的 HCT116 腫瘤異種移植物中以及在 APC10.1 (C) 或 HCT116 細胞 (D) 中表達在收獲前以指定濃度暴露于 TMFol 72 小時。腫瘤組織獲自Apc Min (A) 或 HCT116 異種移植小鼠 (B)，如圖 1 和圖2和3所述。通過蛋白質印跡分析。色譜柱，條帶的光密度評估；6 (對照) 和 12 (TMFol; A) 或 14 至 15 只小鼠 (B) 和 3 (C) 或 4 (D) 獨立細胞暴露實驗的平均值，每個實驗一式三份；酒吧，SD。帶有適當P的星號值表明干預和控制之間的差異是顯著的。通過學生t檢驗 (A) 或通過帶有事后 Bonferoni 校正 (BD) 的單向方差分析進行分析。

圖 5:TMFol 對 HCT116 細胞中 p21-Luc (A) 和 Bax-Luc (B) 構建體的熒光素酶報告基因活性的影響，其中已轉染了合適的螢火蟲熒光素酶序列。值是3個獨立實驗的平均值±SD，星號表示值與對照顯著不同( P <0.01)。有關細胞和轉染的詳細信息，請參閱材料和方法。

腫瘤組織中TMFol水平分析

中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組希望將 TMFol 在裸鼠中延緩 HCT116 腫瘤發(fā)展的能力與在靶組織中達到的藥劑水平聯(lián)系起來。在描述的功效實驗結束時獲得腫瘤組織圖 3并進行 HPLC 分析 (圖 6)。腫瘤中的 TMFol 水平為 146±80pmoles/g 組織(平均值±SD，n=6 只小鼠)，以摩爾濃度計為 146nM。當將個體小鼠的 TMFol 水平與腫瘤負荷進行比較時，未觀察到這兩個參數之間的相關性。

圖 6:HCT116 腫瘤異種移植組織提取物的代表性 HPLC 色譜圖，該提取物來自未使用 (A) 或添加了 TMFol (500ng/ml) (B) 的 AIN93G 飲食的小鼠，或在其一生中接受了強化 TMFol (0.2%) 的 AIN93G 飲食的小鼠( C)。有關色譜條件，請參見材料和方法。is=內標，即2′,5′,5,6,7,8-六甲氧基黃酮。

Ames 試驗中 TMFol 缺乏致突變性

對 TMFol 進行 Ames 回復突變測定，以便在體外建立其誘變潛力。測試了沙門氏菌菌株 TA100、102 和 98，前者表明堿基對取代突變，后者表明移碼突變。在任何細菌培養(yǎng)中，無論是否存在大鼠肝臟代謝激活酶，TMFol 濃度高達 5mg/板都不會引起回復菌落頻率的任何明顯增加。表格1)。相反，合適的模型誘變劑，包括直接作用的基因毒物和需要代謝激活的化學物質，都會導致預期的回復菌落增加。這些結果表明，所用濃度的 TMFol 在該系統(tǒng)中沒有致突變性。

表1:TMFol 在鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗中的作用

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法及基因檢測討論

上述結果證明了對槲皮素分子支架進行明智的結構修飾可以產生在體外缺乏誘變活性并在體內干擾小鼠結腸直腸癌發(fā)生的化合物。雖然槲皮素在一些口腔癌、宮頸癌、肺癌和結腸癌的臨床前模型中顯示出化學預防特性，但它缺乏預防Apc Min小鼠腺瘤發(fā)展的能力。甚至已經證明，膳食濃度為 0.3-3% 的槲皮素會增加而不是抵消偶氮甲烷誘導的嚙齒動物結腸異常隱窩和腺癌的形成 。此外，槲皮素的致突變性及其致癌性的有限證據 (使其不太可能進一步發(fā)展為癌癥化學預防劑。Fisetin 在 Ames 試驗 中的致突變性低于槲皮素，但尚未在Apc Min中研究其延緩腺瘤發(fā)育的能力小鼠，盡管它已顯示出作為推定的前列腺癌化學預防劑的前景。TMFol(此處描述的黃酮醇)的合成受到兩個基本原理的指導：設計黃酮醇支架的致突變性并將結直腸癌化學預防特性賦予分子。后一種預期是基于以下觀察結果，即在結構上與黃酮醇密切相關的黃酮中，與含羥基的對應分子相比，在分子中包含甲氧基部分導致獲得更好的癌癥化學預防特性。例如，5,7-二甲氧基黃酮和 5,7,4'-三甲氧基黃酮說明了甲氧基官能團的存在對癌癥化學預防活性的益處，它們不僅在大鼠中的全身可用性方面優(yōu)于它們的羥基同源物，而且還能夠抑制口腔癌細胞增殖體外。此外，3',4',5',5,7-五甲氧基黃酮 (PMF) 和 tricin (4',5,7-trihydroxy- 3',5'-二甲氧基黃酮) 減少了Apc Min小鼠體內的腺瘤發(fā)展，而芹菜素(4',5,7-三羥基黃酮)沒有。PMF 和 tricin在體外也比芹菜素更有效地抑制腺瘤細胞生長。這些發(fā)現(xiàn)暗示了甲氧基化黃酮在生長抑制特性方面優(yōu)于羥基化黃酮的內在優(yōu)勢。

與甲氧基部分在類黃酮中的化學預防增強作用一致，TMFol 在這里被證明可以在兩種小鼠模型中干擾腫瘤發(fā)生，并在體內參與抗增殖和促凋亡機制。此處描述的研究選擇的膳食劑量相當于每天約 240mg/kg。當根據體表面積比較從小鼠外推至人類時 ，該劑量為 720mg/m 2，因此每 80kg 人每天 1.4g，這是一個相當大但可能可行的劑量。有趣的是，在Apc Min模型表明，TMFol 的腺瘤發(fā)展減少作用僅限于近端腸道。這種組織特異性可以說是腸道部分之間 TMFol 水平差異的結果，其中 TMFol 濃度不足以在近端部分以外的腸道中活動。中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組之前曾報道過 C57BL6/J 小鼠(Apc Min背景菌株)胃腸道黏膜中 TMFol 的濃度，該菌株接受 TMFol 一周的飲食劑量與此處描述的Apc Min小鼠中使用的相同，為 220± 68 nmoles/g 組織，濃度為 220 μM 。這個值是 IC 50的 169 倍用于 TMFol 在 APC10.1 細胞中的生長抑制，如此處所述。本研究未研究Apc Min小鼠腸粘膜中的 TMFol 水平，但可以假設它們與在 C57Bl6/J 小鼠中觀察到的非常相似。在這種情況下需要指出的是，在Apc Min中獲得的結果小鼠，作為人類結直腸癌發(fā)生的模型，需要謹慎解釋，因為該模型存在一些缺點，特別是腫瘤發(fā)展主要發(fā)生在小腸，而不是像人類那樣發(fā)生在結腸的事實，并且在動物垂死之前，腺瘤往往不會發(fā)展到癌的階段。HCT116 異種移植腫瘤和小鼠腸黏膜之間 TMFol 水平的巨大差異反映了藥劑通過前者的循環(huán)進入組織，而后者組織中主要是未吸收的 TMFol。異種移植腫瘤中的 TMFol 水平僅為TMFol 介導的 HCT116 細胞體外生長抑制IC 50的十五分之一，這表明 HCT116 腫瘤細胞在完整的動物環(huán)境中在細胞培養(yǎng)條件下，體內對 TMFol 的抗增殖作用比 HCT116 細胞更敏感。

上述結果表明，在兩種小鼠模型中，TMFol 消耗上調了腫瘤靶組織中野生型 p53 的表達，這種機制很可能有助于觀察到 TMFol 的化學預防功效。伴隨體外HCT116 細胞的初步結果表明，TMFol 上調 p53 具有通過誘導下游啟動子來判斷的功能性后果。引言中提到的 CP-31398  的研究為增加野生型 p53 的表達和激活減少Apc Min小鼠腸腺瘤發(fā)展的觀點提供了令人信服的支持，可能通過抑制腺瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡。之前已經描述了類黃酮在體外細胞中的 p53 調節(jié)能力，盡管據中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測及靶向藥物應用研究重點課題組所知，類黃酮介導的完整動物中 p53 的上調之前僅對黃酮芹菜素 (4' ,5,7-三羥基黃酮) 在攜帶 22Rv1 前列腺腫瘤異種移植物的小鼠中 。10μM 的 TMFol 在體外使 HCT116 細胞中 p53 蛋白的表達增加一倍，據報道非瑟酮具有類似的作用 。相比之下，高達 40μM 的槲皮素未能影響該細胞類型中 p53 的表達(，盡管它增加了 p53 磷酸化狀態(tài)。鑒于此處顯示的體外 APC1.10 細胞中三種黃酮醇的生長抑制效力順序(TMFol>fisetin>槲皮素)，以及槲皮素在Apc Min小鼠中沒有活性的事實，這些差異在p53 調節(jié)效力初步暗示了 p53 上調與小鼠癌癥化學預防活性之間的機制聯(lián)系。如本文所述，TMFol 在Apc Min和 HCT116 異種移植模型中增加 p53 表達的機制仍有待闡明?；谂c CP-31398 的 p53 調節(jié)作用相關的文獻，這些機制可能很復雜并且依賴于模型。值得強調的是，TMFol 可能參與除 p53 調節(jié)以外的抗癌機制，這些機制需要在未來的研究中確定。

黃酮醇的誘變活性與分子支架 ( 環(huán) A 和 B 中的羥基部分有關，它們的甲基化降低了誘變活性 。與這些毒性結構特征一致，TMFol 在 A 環(huán)中沒有羥基部分，在 B 環(huán)中沒有三個甲氧基，在 Ames 試驗中顯示沒有誘變特性。此外，觀察到 TMFol 對小鼠體重或器官病理學沒有有害影響，這預示著它的安全性。然而，TMFol 的假定安全性需要在進一步的臨床前實驗中仔細闡明。

總之，這里描述的 TMFol 的特性支持這樣一種觀點，即基于現(xiàn)有的黃酮醇結構的化學修飾，盡管很少，關于黃酮類結構與化學預防活性或毒性之間關系的信息可能會產生有用的癌癥化學預防劑。可以想象，隨著對黃酮類重要分子靶點及其構效關系的進一步了解，黃酮醇的結構可以進一步優(yōu)化，超越TMFol。然而，鑒于此處描述的有利藥理學特征，TMFol 值得進行額外的臨床前研究，以幫助判斷它是否值得推進到臨床開發(fā)階段。應研究 TMFol 在其他嚙齒動物致癌模型中的化學預防功效。

Preclinical colorectal cancer chemopreventive efficacy and p53-modulating activity of 3',4',5'-trimethoxyflavonol, a quercetin analogue.

Howells LM, Britton RG, Mazzoletti M, Greaves P, Broggini M, Brown K, Steward WP, Gescher AJ, Sale S.

Cancer Prev Res (Phila). 2010 Aug;3(8):929-39. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-09-0236. Epub 2010 Jul 13.

PMID: 20628003