【佳學(xué)基因檢測(cè)】假性軟骨發(fā)育不良基因檢測(cè)案例

【摘要】

假性軟骨發(fā)育不良（PSACH）是一種罕見的常染色體顯性遺傳性骨軟骨發(fā)育障礙，主要表現(xiàn)為短肢型矮小、短指畸形、關(guān)節(jié)松弛、關(guān)節(jié)僵硬及疼痛等。該病由COMP基因突變引起，COMP蛋白在膠原纖維形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。佳學(xué)基因檢測(cè)通過對(duì)兩個(gè)中國(guó)家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（WES），在COMP基因中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新型錯(cuò)義變異：NM_000095.3: c.1319G>T（p.G440V，母方遺傳）和NM_000095.3: c.1304A>T（p.D435V，父方嵌合體）。值得關(guān)注的是，G440V和D435V均位于同一T3重復(fù)基序中，且具有與彼此形成氫鍵的潛力。經(jīng)Missense3D和PyMOL進(jìn)一步分析，證實(shí)這兩種突變具有破壞COMP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的傾向，從而影響其正常功能。本案例豐富了PSACH遺傳學(xué)病因的認(rèn)知，有助于指導(dǎo)臨床診斷及遺傳咨詢。

【關(guān)鍵詞】

假性軟骨發(fā)育不良；COMP基因；全外顯子組測(cè)序；案例報(bào)告；新型錯(cuò)義變異

一、疾病背景

假性軟骨發(fā)育不良（PSACH，OMIM #177170）是一種罕見的骨骼發(fā)育不良疾病，以常染色體顯性方式遺傳，僅需從單親遺傳一個(gè)突變拷貝即可致病?；颊咄ǔＴ诔錾?年內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育正常，之后生長(zhǎng)速度顯著減慢，明顯低于標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線。典型臨床表現(xiàn)包括短肢型矮小、短指畸形、關(guān)節(jié)松弛、關(guān)節(jié)僵硬及疼痛，此外還可出現(xiàn)鴨步步態(tài)、膝內(nèi)翻、肘關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、脊柱側(cè)彎、腰椎前凸和椎管狹窄等。顱面形態(tài)及智力發(fā)育均不受影響，癥狀嚴(yán)重程度因人而異。
 
PSACH由COMP基因（MIM 600310）突變引起，COMP蛋白屬于血小板反應(yīng)蛋白家族，參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的調(diào)控與膠原纖維裝配。COMP蛋白包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端區(qū)域、由II型表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)（T2重復(fù)）和III型鈣調(diào)素樣重復(fù)（T3重復(fù)）構(gòu)成的中心結(jié)構(gòu)域，以及C端球狀結(jié)構(gòu)域（CTD）。其中，T2重復(fù)、T3重復(fù)和CTD均能與鈣離子結(jié)合，對(duì)蛋白質(zhì)的正確折疊及功能發(fā)揮至關(guān)重要。COMP突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)喪失和錯(cuò)誤折疊，使大量COMP滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），從而引發(fā)骨骼異常，如PSACH或多發(fā)性骨骺發(fā)育不良（MED）。
 
在PSACH患者中，突變主要集中在T3重復(fù)區(qū)，CTD區(qū)的突變相對(duì)少見。研究表明，當(dāng)變異位于T3重復(fù)區(qū)時(shí)，患者的身材矮小程度可能更為嚴(yán)重。T3重復(fù)C型基序中的特定錯(cuò)義變異導(dǎo)致PSACH，而N型基序的錯(cuò)義變異通常引起較輕癥的MED。值得注意的是，同一位點(diǎn)的不同突變也可導(dǎo)致不同的疾病嚴(yán)重程度。

二、佳學(xué)基因檢測(cè)方法

2.1 DNA提取與測(cè)序

采用DNeasy血液與組織試劑盒（Qiagen）從受檢者外周血提取基因組DNA；胎兒DNA來源于羊水樣本。使用Agilent SureSelect Human All Exon v.6進(jìn)行靶向外顯子組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，在HiSeq X Ten平臺(tái)（Illumina Inc.）上進(jìn)行高通量測(cè)序，讀長(zhǎng)比對(duì)至NCBI人類參考基因組（hg19/GRCh37），采用GATK流程進(jìn)行變異識(shí)別，ANNOVAR進(jìn)行變異注釋。

2.2 Sanger驗(yàn)證

對(duì)發(fā)現(xiàn)的候選變異均采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用VarSite、Missense3D及PyMOL對(duì)G440V和D435V變異對(duì)COMP蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來源于歐洲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDBe）。通過PyMOL對(duì)野生型與變異型COMP蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析與可視化。

三、受檢家系臨床表現(xiàn)

3.1 家系一

先證者為31歲女性，身高135 cm，因身材矮小就診并尋求遺傳與產(chǎn)前診斷。其母親（身高140 cm）及姐姐（身高142 cm）均表現(xiàn)出相似表型，包括短指畸形、鴨步步態(tài)、膝內(nèi)翻、輕度胸廓變形及肘關(guān)節(jié)伸展受限，母親還伴有退行性膝關(guān)節(jié)病變。所有受累個(gè)體顱面形態(tài)正常，甲狀腺功能檢查正常。先證者母親的X線影像顯示手部短指畸形、尺骨遠(yuǎn)端縮短及膝關(guān)節(jié)輕度骨關(guān)節(jié)炎改變，骨盆、椎體及腰椎形態(tài)正常，無脊柱側(cè)彎。

3.2 家系二

先證者為28歲女性，身高100 cm，因孕期前來進(jìn)行產(chǎn)前診斷。其3歲兒子（身高79.5 cm）表現(xiàn)出與母親相似的臨床特征，包括肢體比例失調(diào)（短肢）、鴨步步態(tài)、膝內(nèi)翻及肘關(guān)節(jié)伸展受限。先證者兒子的X線檢查顯示：手部短指畸形、橈尺骨遠(yuǎn)端干骺端張開伴骨密度增高；雙側(cè)股骨及脛骨長(zhǎng)骨骨骺端不規(guī)則且粗糙，干骺端增寬，骨骺縮小，關(guān)節(jié)間隙增寬，膝關(guān)節(jié)內(nèi)旋異常；存在脊柱側(cè)彎及椎體舌狀突起，未見椎間隙變窄。另見恥骨下支縮短、坐骨-恥骨線寬增加及股骨粗線增寬。先證者父親除影像學(xué)發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔積液外，無明顯臨床異常表現(xiàn)。
   

臨床特征	家系1 I-2	家系1 II-1	家系1 II-2	家系1 II-3	家系2 III-3	家系2 IV-1
性別	女	女	女（先證者）	女	女（先證者）	男
年齡	54歲	26歲	31歲	53歲	28歲	3歲
身高(cm)	140	142	135	160	100	79.5
發(fā)病年齡	2歲	2歲	2歲	50歲	2歲	2歲
步態(tài)異常	+	+	+	−	+	+
短指畸形	+	+	+	−	+	+
膝內(nèi)翻	+	+	+	−	+	+
肘關(guān)節(jié)伸展受限	+	+	+	−	+	+
退行性關(guān)節(jié)病	+	−	−	+	−	−

 
注：+，表現(xiàn)陽(yáng)性；−，表現(xiàn)陰性。

四、佳學(xué)基因檢測(cè)遺傳分析結(jié)果

4.1 家系一：c.1319G>T（p.G440V）變異

在家系一中，佳學(xué)基因檢測(cè)對(duì)先證者及其胎兒進(jìn)行了WES分析，在先證者的COMP基因中發(fā)現(xiàn)新型變異NM_000095.3: c.1319G>T（p.G440V）。該變異同樣存在于胎兒中，家屬?zèng)Q定于妊娠19周終止妊娠。Sanger測(cè)序驗(yàn)證顯示，該變異與PSACH表型共分離：先證者、其姐姐及母親均攜帶雜合COMP突變，而表現(xiàn)正常的父親則未攜帶該突變。
 
依據(jù)ACMG指南，該變異被判定為可能致病性變異（PM1+PM2_Supporting+PM5+PP1+PP3），理由如下：

• 變異位于血小板反應(yīng)蛋白III型重復(fù)功能域（PM1）；
• gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中未見該變異頻率記錄（PM2_Supporting）；
• 該位點(diǎn)已報(bào)告其他已知致病錯(cuò)義變異，如c.1318G>A（p.Gly440Arg）、c.1318G>C（p.Gly440Arg）及c.1319G>A（p.Gly440Glu）（PM5）；
• 變異與受累家系中的PSACH表型共分離（PP1）；
• 多個(gè)生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)該突變對(duì)COMP具有有害影響（PP3）。

4.2 家系二：c.1304A>T（p.D435V）變異

在家系二中，Trio-WES分析發(fā)現(xiàn)COMP基因中的新型變異NM_000095.3: c.1304A>T（p.D435V）。該變異已于2020年1月提交至ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)，由Blueprint Genetics標(biāo)注為可能致病，但缺乏詳細(xì)臨床背景信息。本家系中，先證者與其兒子均攜帶該變異，胎兒（IV-2）亦攜帶，家屬?zèng)Q定終止妊娠。Sanger測(cè)序證實(shí)先證者攜帶該突變，并確認(rèn)為父方來源。值得注意的是，先證者父親僅有關(guān)節(jié)腔積液而無典型PSACH表型，WES分析顯示c.1304A>T在其15%的測(cè)序讀數(shù)中檢出，提示其為嵌合體攜帶者，可解釋其較輕的臨床表現(xiàn)。
 
該變異依據(jù)ACMG指南被判定為可能致病性變異（PM1+PM2_Supporting+PP1+PP3+PP4）。

五、變異對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響分析

氨基酸殘基Gly440與Asp435在不同物種間均高度保守。在gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中，Gly440位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)自然變異，已報(bào)告的變異（G440G、G440E及本次新發(fā)現(xiàn)的G440V）CADD評(píng)分均高于25，提示致病可能性大；Asp435的CADD評(píng)分為32，亦提示可能有害。
 
Gly440殘基原本位于蛋白質(zhì)的彎曲曲率區(qū)，DSSP算法將其二級(jí)結(jié)構(gòu)歸類為S型。甘氨酸側(cè)鏈極小，構(gòu)象靈活性高，常存在于多肽鏈發(fā)生急劇轉(zhuǎn)彎的環(huán)區(qū)。當(dāng)任何其他氨基酸取代Gly440時(shí)，會(huì)增加構(gòu)象變化所需能量，影響蛋白質(zhì)整體穩(wěn)定性，因此被認(rèn)為是有害替換。
 
Asp435殘基位于T3重復(fù)區(qū)，每個(gè)重復(fù)序列包含兩個(gè)DxDxDGxxDxxD基序。Asp殘基攜帶負(fù)電荷，能與鈣離子結(jié)合，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要。Asp435與鈣離子CA817協(xié)同Asp437、Asp439、His441及Asp446共同發(fā)揮作用。D435V突變使Asp435失去負(fù)電荷，破壞其與CA817的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)去穩(wěn)定化。此外，Asp435還參與與Gly438和Gly440形成氫鍵；D435V雖不影響與Gly438的氫鍵，但會(huì)干擾與Gly440的氫鍵，這一雙重破壞（氫鍵+鈣離子結(jié)合）或可解釋D435V相較于G440V臨床表型更為嚴(yán)重的原因。
 
綜上，這兩種錯(cuò)義突變極可能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留，通過顯性負(fù)效應(yīng)干擾野生型COMP及其他軟骨蛋白的正常功能，是導(dǎo)致假性軟骨發(fā)育不良的重要分子機(jī)制。

六、佳學(xué)基因檢測(cè)綜合解讀

本次檢測(cè)對(duì)兩個(gè)PSACH中國(guó)家系進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)COMP基因新型雜合可能致病性變異（c.1319G>T和c.1304A>T），均位于第六個(gè)T3鈣結(jié)合重復(fù)（T36）區(qū)域，與既往Briggs等研究建立的基因型–表型關(guān)聯(lián)高度吻合（致病性錯(cuò)義變異主要集中于第6–8型T3鈣結(jié)合重復(fù)，即T36–T38）。
 
本案例檢測(cè)結(jié)果的主要價(jià)值體現(xiàn)在以下三個(gè)方面：

• 擴(kuò)展了COMP基因變異譜，為數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充了經(jīng)家系驗(yàn)證的新型致病變異；
• 證實(shí)了嵌合體父方（僅有關(guān)節(jié)腔積液）可將完全外顯的PSACH傳遞給子代，對(duì)遺傳咨詢具有重要提示意義；
• 通過結(jié)構(gòu)分析揭示了T3重復(fù)區(qū)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的具體機(jī)制，為PSACH發(fā)病機(jī)理研究提供了新證據(jù)。

 
佳學(xué)基因檢測(cè)建議，對(duì)于臨床高度疑似PSACH或MED的患者，可進(jìn)行COMP基因的靶向測(cè)序或全外顯子組測(cè)序，以明確分子診斷，指導(dǎo)家庭遺傳咨詢及生育決策。
本報(bào)告由佳學(xué)基因檢測(cè)出具，僅供臨床參考，最終診斷請(qǐng)結(jié)合臨床綜合判斷。

(如果您已經(jīng)做了基因檢測(cè)，想獲取與基因檢測(cè)型相對(duì)應(yīng)的治療方案，請(qǐng)點(diǎn)擊此處上傳您的基因檢測(cè)結(jié)果）

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)