【佳學基因檢測】北京非綜合征唇腭裂遺傳病基因檢測

遺傳病基因檢測關于疾病的介紹

非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）是全球最常見的先天性出生缺陷之一。根據(jù)《基因檢測可以阻斷遺傳的遺傳病》，每1000個新生兒就會有一例非綜合征性唇腭裂。非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P可分為五種類型——（A）唇裂及牙槽裂，（B）腭裂，（C）不完全單側唇裂合并腭裂，（D）完全單側唇裂合并腭裂，（E）完全雙側唇裂合并腭裂——。佳學基因采用基因解碼發(fā)現(xiàn)，這些類型均由人類胚胎發(fā)育第4到第10周間間充質(zhì)組織在細胞遷移、增長、分化和凋亡中的異常造成。盡管這類畸形不是主要的死亡原因，但其對健康的終身影響以及對患者和家庭造成的巨大的經(jīng)濟和社會負擔，使其治療具有一定的困難。以往研究表明，非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因具有異質(zhì)性，且與遺傳和環(huán)境因素密切相關。然而，在遺傳性非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族中，單基因突變可能具有更重要的意義。關于非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族中共享相關突變基因的研究較少。因此，識別易感變異在非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的預防、治療和預后中具有重要作用。

全基因組測序（WGS）和全外顯子測序（WES）是醫(yī)學遺傳學中最廣泛使用和有效的基因組學方法，這些方法能夠更全面地識別單核苷酸變異（SNV）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失突變（INDEL）、拷貝數(shù)變異（CNV）和結構變異（SV）。全基因組測序?qū)λ谢蜻M行測序，檢測外顯子、內(nèi)含子和調(diào)控序列，篩選基因組中的遺傳變異，支持基因型多樣性分析、遺傳進化分析、疾病發(fā)病機制研究和易感基因篩查。WGS在各種疾病的研究、篩查和監(jiān)測中越來越多地被應用。致病基因鑒定基因解碼使用WGS識別了基因與疾病之間的關聯(lián)，基因檢測機構通過WGS發(fā)現(xiàn)了高風險兒童癌癥的可操作靶點。全外顯子測序（WES）是一種更高效、完整、特異且經(jīng)濟的測序技術，用于研究遺傳性疾病的病因。佳學基因等通過WES識別了非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P中的變異基因，發(fā)現(xiàn)易感基因不僅有助于揭示非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因，還幫助診斷和治療非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P患者。許多基因解碼探討了非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的成因。這些基因解碼基因檢測表明，由于不同的遺傳背景，不同人群可能有不同的致病變異?！洞诫窳训闹虏』蜩b定基因解碼》總結了與出生缺陷病因相關的多種基因。有關中國人群非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P相關基因組位點突變的深入分析是佳學基因解碼的重點關注課題

這一基因解碼基因檢測的病例分析通過測序技術對南方中國一個家庭中與非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P相關的de novo RESP18 rs2385404和rs2385405基因多態(tài)性進行了基因組分析。我們的發(fā)現(xiàn)為非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因提供了重要的見解。
 

非綜合征唇腭裂遺傳病材料與方法

參與者

佳學基因檢測從廣州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院所送檢測的一個由5人組成的遺傳性非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族。成人及兒童的父母/監(jiān)護人均提供了遺傳病基因檢測的知情同意。邀請了三名具有主治醫(yī)師資格的整形外科醫(yī)生進行臨床檢查和診斷。進行了全面的身體檢查，以排除其他器官畸形、畸形，根據(jù)臨床特征診斷為唇腭裂CL/P?？紤]到來自同一遺傳家族的5名受試者生活在相同環(huán)境中，因此在分析時認為5名患者的生活環(huán)境是相同的。整個基因檢測分析符合醫(yī)學倫理審查部的審查。

佳學基因檢測從每位參與的家庭成員處獲得了臨床信息和外周血樣本。五名成員參與了研究（見圖1，黑色虛線矩形）。其中三名成員有完全唇裂合并腭裂，另外兩名為正常對照（正常1和正常2）。父母分別為II3（Cleft 1）和II4（Cleft 2），兩人均有單側完全唇裂合并腭裂，而III2（Cleft 3）為有雙側完全唇裂合并腭裂的兒子。

• II3、II4 和 III2 是表現(xiàn)出 NSCLP 表型的個體（即患者）。
• I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3 和 III4 是家系中沒有 NSCLP 表型的成員。
• II3、II4、III2、III3 和 III4 分別代表 Cleft_1、Cleft_2、Cleft_3、Normal_1 和 Normal_2。
• 黑色符號 表示受影響的成員。
• 箭頭 指向家系圖中的 proband（研究的起始個體）。
• 五名成員 參與了研究，這些成員在 圖 1 中的黑色虛線矩形 內(nèi)標出。

說明：

1. 具有 NSCLP 的家族成員：

   • II3、II4 和 III2 是表現(xiàn)出非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）表型的個體，說明這些人有該病，但沒有其他綜合征或先天性異常。

2. 沒有 NSCLP 的家族成員：

   • 其他列出的家族成員（I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3 和 III4）則沒有表現(xiàn)出 NSCLP 表型。

3. 家系圖中的標記：

   • 黑色符號 代表家系中患有 NSCLP 的成員。
   • 箭頭 指向 proband（研究起始個體），這個個體是研究的主要關注對象。
   • 五名參與者 被標出在家系圖的 黑色虛線矩形 內(nèi)，表示他們參與了該研究。

基因檢測幫助下的家庭情況

非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）家系的臨床表現(xiàn)：

• (A) (II3) 和 (B) (II4) 是擁有單側完全唇裂和腭裂的父母，他們在手術后恢復情況。
• (C) (III2) 是有雙側完全唇裂和腭裂的兒子，他在手術前的情況。
• (D) 顯示了 proband（研究的起始個體）手術后1年的臨床特征。

說明：

1. 家族成員的臨床表現(xiàn)：

   • (II3) 和 (II4) 作為父母，均有單側完全唇裂和腭裂，并在手術后恢復了健康。手術后的恢復情況顯示他們的病情得到了改善。
   • (III2) 是他們的兒子，在手術前患有雙側完全唇裂和腭裂，說明他的病情比父母更為嚴重。
   • (D) 中的圖像展示了研究個體（proband）在手術后1年的臨床特征，提供了關于手術效果和恢復情況的重要信息。

2. 基因檢測的幫助：

   • 了解遺傳因素：基因檢測可以幫助確認是否存在遺傳性因素導致 NSCLP，從而提供更多關于家族成員病情的背景信息。
   • 制定個性化治療方案：基于基因檢測的結果，醫(yī)生可以為每位家庭成員制定個性化的治療和康復計劃，以提高治療效果。
   • 評估遺傳風險：通過基因檢測，家族成員可以了解自己是否攜帶相關的遺傳變異，幫助預測后代的遺傳風險，制定相應的預防和干預措施。

總體而言，基因檢測能幫助確定家族中非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）的遺傳基礎，為家族成員提供科學的遺傳風險評估，并優(yōu)化個體化治療方案。

全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES）由佳學基因醫(yī)學技術（北京）有限公司（中國北京，www.alivewithwords.com）執(zhí)行?；蚪MDNA從患者的外周血中提取。使用RNA 6000 Nano LabChip試劑盒（Agilent，CA，美國）確保基因組DNA樣品質(zhì)量高，OD 260/280比率為1.8–2.0。使用高靈敏度DNA芯片試劑盒（Agilent，CA，美國）和Agilent SureSelect Human All Exon V6（Agilent，CA，美國）構建的DNA文庫進行了測序，并在Illumina HiSeq2500/4000測序平臺上運行。

在比對步驟中，測序讀取通過Burrows-Wheeler比對器（BWA，牛津，英國）與參考基因組（UCSC基因組瀏覽器 hg19）對齊，然后通過Samtools（v1.3.1）進行排序，并通過Picard（v1.141）去除重復標記。在第二次后比對處理步驟中，進行局部讀取重新對齊以修正插入缺失（indel）周圍的潛在比對錯誤。由于插入缺失邊緣附近的讀取映射通常會導致錯配堿基，從而產(chǎn)生假陽性SNP調(diào)用，局部重新對齊利用這些錯配堿基確定是否應重新對齊，并應用計算密集型算法來確定讀取相對于插入缺失的最一致位置，去除比對偽影。更多詳細信息可從佳學基因醫(yī)學技術（北京）有限公司（中國北京，www.alivewithwords.com）。

變異檢測

每個讀取具有與測序錯誤概率相關的質(zhì)量評分。由于系統(tǒng)性偏差，報告的質(zhì)量評分已知不準確，因此在基因分型之前必須重新校準。重新校準后，輸出BAM中的重新校準質(zhì)量評分將更接近測序錯誤的概率[25]。

可以使用基因組分析工具包（GATK，https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices）生成變異調(diào)用，該工具包通過貝葉斯推斷檢查參考變異的證據(jù)。高斯混合模型適用于為每個假定變異調(diào)用分配準確的置信評分，并評估新的潛在變異。

變異注釋

生物功能注釋是找到遺傳變異與疾病之間聯(lián)系的關鍵步驟。使用SnpEff添加生物信息到變異集合中。使用ANNOVAR軟件工具和內(nèi)部代碼對所有突變進行注釋，并參考臨床變異數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）。為了進一步篩選，使用1000基因組計劃（http://www.1000genomes.org/）、外顯子聚合聯(lián)盟（ExAC）瀏覽器、SIFT（http://sift.jcvi.org）和PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）預測變異功能。

桑格測序

桑格測序由SJ-Bio有限公司（中國廣州，www.saikabio.com）執(zhí)行。使用Premier 3.0設計引物；引物序列見附表1。桑格測序產(chǎn)品通過ABI 3730遺傳分析儀分離，數(shù)據(jù)使用Chromas V1.0.0.1進行分析。

非綜合征唇腭裂遺傳病基因檢測結果

臨床特征

受試者是一家來自南方的漢族家庭，具有家族性非綜合征性唇裂和腭裂（見圖1）。在該家庭中，II3、II4和III2是表現(xiàn)為非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的先證者。I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3和III4是沒有非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P表型的家族成員。在佳學基因檢測分析的這一病例中，合計有5名成員，其中三人有完全性唇裂和腭裂，兩人作為正常對照。所有患者均在廣州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院的唇腭裂治療中心進行診斷和治療。其中II3（見圖2A）和II4（見圖2B）為父母，術后為單側完全性唇裂和腭裂；III2（見圖2C）為兒子，術前為雙側完全性唇裂和腭裂。圖2D顯示了先證者術后1年的臨床特征。根據(jù)這些臨床特征，使用全基因組測序和全外顯子組測序檢測可能的遺傳損傷，以揭示疾病發(fā)生的基因原因，并幫助家族阻斷這種多代發(fā)生的現(xiàn)象。

基因組測序

對非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家庭的5名成員進行了全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES）。WGS原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量因篇幅原因不在此處展示。Phred質(zhì)量評分（Q），即基于錯誤率P的對數(shù)，描述了每個測序堿基的可靠性。例如，如果一個堿基正確率為99%，則質(zhì)量值為20（Q20）；如果堿基正確率為99.9%，則質(zhì)量值為30（Q30）。在WGS結果中，總有效數(shù)據(jù)范圍為92.56億堿基對（Gb），深度（x）為31.98到108.5億堿基對（Gb），深度（x）為37.49。有效數(shù)據(jù)的平均比率為99.9%。Q20%、Q30%和GC%的平均比率分別為97.64%、93.70%和41.31%。WES原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量總結通過表格展示，此處省略。總有效數(shù)據(jù)的平均值為12.60億堿基對（Gb），深度（x）為217.24。有效數(shù)據(jù)的平均比率為98.2%。Q20%、Q30%和GC%的平均比率分別為98.35%、95.47%和53.44%。在2×最小深度測量下，目標區(qū)域覆蓋率為97.61%。在10×、20×和30×測量下，目標覆蓋率分別為96.04%、92.15%和85.00%。因此，深度和覆蓋率應足以可靠地檢測大多數(shù)目標區(qū)域內(nèi)的DNA變異。

遺傳發(fā)現(xiàn)

使用1000基因組計劃、外顯子聚合聯(lián)盟（ExAC）瀏覽器、SIFT和PolyPhen-2對結構變異功能進行了注釋。結果篩選出總計7624個突變，包括WGS隊列中的1754個突變（23.0%）和WES隊列中的123個突變（1.6%）。WGS、WES和臨床變異數(shù)據(jù)庫的綜合分析顯示，在3個研究隊列中共有9個位點變異（RESP18、LSR、SPATS2L、ZNF277、IHH、C2orf69、KIR3DL1、MUC3A和PRKAG3）（見圖5）。在這些變異位點中，發(fā)現(xiàn)RESP18基因中的2個突變位點（rs2385404和rs2385405），這些突變位點與唇裂和腭裂相關，并且在非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P患者中同型突變伴有更嚴重的癥狀，這些突變是非同義單核苷酸變異（SNVs），導致功能變化。由于未發(fā)現(xiàn)類似的錯義變異，例如某些是同義變異或與RESP18調(diào)控內(nèi)分泌特異性蛋白18關系較小，排除了8個突變。為了驗證WES檢測到的DNA序列變異，使用了標準方法桑格測序。

桑格測序

通過桑格測序，在所有5名家庭成員中檢測到了RESP18基因（NM_001007089.4）的2個變異位點（rs2385404和rs2385405）。桑格測序驗證顯示，rs2385404和rs2385405的突變與WGS和WES結果一致。桑格測序結果表明，RESP18的突變（rs2385404，c.90G>T，p. Glu30Asp）導致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu轉變?yōu)锳sp。桑格測序結果還表明，RESP18變異（rs2385405，c.157G>A，p. Glu53Lys）導致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu轉變?yōu)長ys。這兩個變異均為錯義變異。因此，這一結果確認了RESP18基因變異是該家系中的致病變異。

非綜合征唇腭裂遺傳病基因檢測結果的解釋與說明

Sanger測序確認了RESP18基因序列（GRCh38.p14 chr2）中的變異（rs2385404和rs與2385405）。

• (A) Sanger測序顯示，RESP18基因的突變（rs2385404，c.90G>T，p. Glu30Asp）導致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu（谷氨酸）變成了Asp（天冬氨酸）。

• (B) Sanger測序結果顯示，RESP18變異（rs2385405，c.157G>A，p. Glu53Lys）導致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu（谷氨酸）變成了Lys（賴氨酸）。

在這個結果中，Glu – 谷氨酸，Asp – 天冬氨酸，Lys – 賴氨酸。

解釋：

1. 變異的確認：

   • rs2385404 和 rs2385405 是在RESP18基因中的兩個已知變異位點，Sanger測序技術確認了這些變異的存在。

2. 具體的突變信息：

   • (A) rs2385404變異（c.90G>T）表示在RESP18基因的第90位堿基由G（鳥嘌呤）突變?yōu)門（胸腺嘧啶），導致RESP18蛋白的第30位氨基酸由Glu（谷氨酸）變?yōu)锳sp（天冬氨酸）。這種氨基酸的改變可能影響蛋白質(zhì)的功能。
   • (B) rs2385405變異（c.157G>A）表示在RESP18基因的第157位堿基由G（鳥嘌呤）突變?yōu)锳（腺嘌呤），導致RESP18蛋白的第53位氨基酸由Glu（谷氨酸）變?yōu)長ys（賴氨酸）。這同樣可能對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響。

3. 氨基酸變化的意義：

   • Glu（谷氨酸） 和 Asp（天冬氨酸） 都是酸性氨基酸，但它們的化學性質(zhì)略有不同，這種變化可能影響蛋白質(zhì)的結構或功能。
   • Lys（賴氨酸） 是堿性氨基酸，替換掉Glu（谷氨酸）可能會顯著改變蛋白質(zhì)的電荷和功能。

總體來說，這些變異可能會對RESP18蛋白的功能產(chǎn)生影響，進而對與該基因相關的生理過程或疾病風險產(chǎn)生潛在影響?；驒z測結果有助于理解這些變異的具體作用及其可能的臨床意義。

佳學基因檢測唇腭裂基因檢測的優(yōu)勢

非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）是中國最常見的先天性畸形之一，其中近20%為家族性病例。NSCLP與多種因素相關，其發(fā)病機制并非為很多臨床醫(yī)生所知曉。本病例分析認為，易感基因與胚胎發(fā)育過程中腭部形態(tài)發(fā)生異常和組織融合的NSCLP密切相關。通過連鎖分析、基因組重排、候選基因以及全基因組關聯(lián)研究（GWAS）等多種方法，研究人員發(fā)現(xiàn)了與NSCLP相關的關鍵基因。例如，SATB2和IRF6基因上發(fā)現(xiàn)的幾個變異與NSCLP的原因密切相關?；蚪獯a通過GWAS研究識別了41個具有全基因組顯著性的SNPs，這些SNPs位于14個基因（RAD54B、TMEM19、KRT18、WNT9B、GSC/DICER1、PTCH1、RPS26、OFCC1/TFAP2A、TAF1B、FGF10、MSX1、LINC00640、FGFR1和SPRY1）的26個基因座上。致病基因鑒定分析過程中進行了非洲的全基因組測序（WGS）分析，識別了162個高置信度的致病性新生突變（DNMs）。基因解碼對來自獨立家庭的個體進行全外顯子組測序（WES），建議5個候選基因（ACACB、PTPRS、MIB1、GRHL3、CREBBP）的稀有變異可能與NSCLP風險相關。通過聚合酶鏈反應和Sanger測序?qū)WAS中與歐洲人群NSCLP密切相關的Vax1基因的rs7078160進行基因分型，并通過病例對照和家系關聯(lián)研究比較了突變。因此，NSCLP可能與候選基因的突變有關。

在本病案中，佳學基因檢測使用了全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES）來識別在東南部漢族NSCLP家族中的易感變異。在這個家族中，父母（II3和II4）有單側完全唇裂和腭裂，而III2有雙側完全唇裂和腭裂?；蚪M分析顯示該NSCLP家族中RESP18基因存在2個突變。巧合的是，患者II3和II4具有雜合突變，而III2具有純合突變。唇腭裂致病基因鑒定基因解碼的結果表明，NSCLP的表型差異和嚴重程度與RESP18基因突變相關。進一步的Sanger測序結果也得出了相同的結論。因此，唇腭裂致病基因分析認為RESP18是NSCLP發(fā)展的一個重要基因，并且與腭裂的嚴重程度相關。

調(diào)節(jié)性內(nèi)分泌特異性蛋白18（RESP18）是一種18千道爾頓的蛋白，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中。作為促腎上腺皮質(zhì)激素分泌途徑中的重要糖皮質(zhì)激素反應蛋白，RESP18受多巴胺、糖皮質(zhì)激素和胰島素等生理和藥理刺激的調(diào)節(jié)。此外，RESP18參與調(diào)節(jié)邊緣系統(tǒng)和自主功能，調(diào)控細胞骨架和神經(jīng)突生長，從而通過轉錄后O-糖基化影響器官發(fā)育。因此，RESP18可能是面部頜部發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，其異常表達對唇裂和腭裂的發(fā)生有重大影響。

總之，NSCLP的發(fā)生率和病情與RESP18基因突變相關?；蚪獯a認為推測RESP18基因在唇裂和腭裂的發(fā)病機制中扮演著重要角色，并且該基因可能與NSCLP家族的病因預測有關。

創(chuàng)新性說明：

1. 應用全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES）：

   • 本案例采用WGS和WES技術來識別NSCLP的易感變異，這是相對于傳統(tǒng)方法（如GWAS和單一基因分析）的一種創(chuàng)新。這種方法提供了更全面的基因組信息，有助于發(fā)現(xiàn)那些可能被遺漏的變異。

2. 發(fā)現(xiàn)RESP18基因的相關性：

   • 研究發(fā)現(xiàn)RESP18基因的突變與NSCLP的嚴重程度相關，這一發(fā)現(xiàn)明確了RESP18在NSCLP中的作用。這一發(fā)現(xiàn)有助于進一步理解NSCLP的遺傳機制，并提供了新的研究方向。

3. 對表型和基因型的關聯(lián)分析：

   • 通過將表型（如唇裂和腭裂的類型和嚴重程度）與基因型（如RESP18的突變類型）進行詳細關聯(lián)分析，研究揭示了基因變異如何影響臨床表現(xiàn)。這種方法的創(chuàng)新性在于將遺傳變異與具體的臨床特征直接關聯(lián)，為個體化治療提供了依據(jù)。

4. 潛在的臨床應用：

   • 研究結果提示RESP18可能作為NSCLP的生物標志物，用于早期預測和風險評估，這對臨床診斷和預防具有重要意義。