【佳學基因檢測】臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識

病理分析水平與機構(gòu)要求的理解

臨床分子病理是病理科的一個分支學科，由佳學基因等第三方臨床醫(yī)學實驗室出具的基因解碼、高水平的基因檢測的報告是疾病病理分析先進水平。在國際上這一業(yè)務由醫(yī)學檢驗實驗室承擔具有其必然性和可行性，同時也是對病理分析水平的一種高效。但是醫(yī)學檢驗實驗室只有遵循專家共識，并在此基礎上進一步發(fā)展，才會在腫瘤及遺傳病的診斷和治療上發(fā)揮這一高新技術(shù)應有的作用。佳學基因積極支持、并遵循這一國家層面上的行業(yè)標準。

《臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識》編寫組

近年二代基因測序（next-generation sequncing，NGS）技術(shù)快速發(fā)展，其應用已進展至臨床檢測，如遺傳疾病、實體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。 國內(nèi)外有關(guān)學會已出臺相關(guān)共識與指南以推動其在臨床中的應用[1-4]。 中華醫(yī)學會病理學分會和中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會前期組織病理、臨床、生物信息等專家進行了充分討論，擬在NGS的操作流程、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果解讀等方面作規(guī)范和建議，以規(guī)范NGS在分子病理領(lǐng)域的應用。

臨床分子病理實驗室NGS樣本可采用甲醛固定石蠟包埋（ formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織、新鮮組織、各種體液及其上清液、體液離心細胞蠟塊、血漿/血液標本等。 本共識特色是基于病理評估的組織樣本（FFPE組織、新鮮組織）而形成的規(guī)范。 測序分析范圍基于目前臨床需求，本共識著重于目標區(qū)域測序（panel）分析的實踐。 隨著技術(shù)的更新和應用的成熟，本共識將持續(xù)更新以滿足臨床需求。

一、實驗室總體要求

NGS檢測實驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實驗室建設指南（試行）》、《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》、《個體化醫(yī)學檢測質(zhì)量高效指南》、《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南》、《個體化醫(yī)學檢測實驗室管理辦法》、《測序技術(shù)的個體化醫(yī)學檢測應用技術(shù)指南（試行）》進行[5-7]。

1. NGS檢測人員的資質(zhì)要求：NGS檢測技術(shù)人員應具備臨床病理學、分子生物學的相關(guān)專業(yè)大專以上學歷，并經(jīng)過NGS技術(shù)的理論與技能培訓合格，同時具有臨檢中心《臨床基因擴增實驗室技術(shù)人員培訓合格證》。 數(shù)據(jù)分析人員應具有臨床醫(yī)學、分子生物學或遺傳學知識背景并經(jīng)生物信息學培訓。 賊終報告應由中級或碩士以上具有病理學背景、經(jīng)培訓合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權(quán)簽字人（高級職稱或醫(yī)學博士學位）審核。
2. NGS檢測實驗室的區(qū)域設置要求：原則上NGS實驗室應當有以下區(qū)分：樣本前處理區(qū)、試劑存儲和準備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)、雜交捕獲區(qū)/多重PCR區(qū)域（先進擴增區(qū)）、文庫擴增區(qū)（第二擴增區(qū)）、文庫檢測與質(zhì)控區(qū)、測序區(qū)、數(shù)據(jù)存貯區(qū)。各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》配置。分區(qū)可根據(jù)實際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本與組織樣本分開。
3. NGS檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺應選擇中國食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）承認產(chǎn)品。 涉及實驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規(guī)程（SOP），需經(jīng)過臨床實驗室自建項目（LDT）驗證合格才可使用。 每個NGS檢測項目在驗證時需要根據(jù)建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型，包括單堿基突變（single nucleotide variant，SNV）、小片段插入或者缺失（Indel）、基因拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）、染色體結(jié)構(gòu)變異（structural variation，SV）以及不同的樣本類型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定panel的正確性、正確性、敏感性、特異性等性能參數(shù)進行 LDT驗證。 應該有經(jīng)過標準品測試的在不同的變異頻率（mutant allele frequencies，MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異度數(shù)據(jù)，確定不同樣本的可信的測序深度。 經(jīng)驗證后，SOP發(fā)生的任何改動，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。 驗證實驗結(jié)果簽名留底備案。
4. NGS檢測實驗室的質(zhì)量管理要求：NGS檢測主要包括實驗操作和生物信息學分析兩部分。 實驗操作部分包括樣本準備、文庫制備、 編碼（barcoding）、目標區(qū)域富集、測序等；生物信息學分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。 上述流程均需要建立實驗室質(zhì)量管理體系文件和SOP及機器運行和維護SOP，具有嚴格的室內(nèi)質(zhì)控措施；定期參加室間質(zhì)評以及有持續(xù)的質(zhì)量高效和改進計劃。

二、NGS分析樣本、基因panel和轉(zhuǎn)運要求

NGS分析樣本類型可采用FFPE組織、新鮮組織、各種體液及其上清液、體液離心細胞蠟塊和血漿/血液標本等。
對于腫瘤體細胞變異初次NGS檢測應先進經(jīng)病理評估的組織樣本，在此數(shù)據(jù)基礎上的再次檢測可選取液體樣本動態(tài)監(jiān)測。
NGS檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量，根據(jù)不同腫瘤類型選擇合適的基因panel測序[8-11] 。
不同疾病的基因panel列表，必須由臨床與檢測機構(gòu)的專家共同決定，在滿足臨床需求的同時達到賊優(yōu)化的實驗設計。
未經(jīng)病理評估的基因檢測結(jié)果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。
樣本質(zhì)量對檢測結(jié)果和分析至關(guān)重要，病理醫(yī)師需要對可評估的樣本進一步明確病理診斷，并評價標本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含HCI脫鈣液處理），病變細胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。 組織標本中腫瘤細胞含量建議達到20%以上， 低于此標準可富集后檢測[12]。
NGS檢測實驗室應對不同類型的樣本有采集及處理SOP指導。 對于不同的樣本(FFPE組織、體液、血液等）實驗室應有不同的樣本運送SOP，物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運輸）應有相關(guān)運送記錄，確保樣本運送安全、無污染、無降解。
 

三、NGS檢測流程中的質(zhì)量標準

1. 核酸提取及其質(zhì)量分析：提取的核酸質(zhì)量是NGS檢測成功的關(guān)鍵因素，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質(zhì)量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據(jù)不同的樣本類型制定相應的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。 對應明確接受和拒絕的標準。
2. 文庫制備及其質(zhì)量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區(qū)域或突變熱點進行描述，并建立實驗室檢測SOP。 建立好文庫后上機測序前需對文庫進行質(zhì)量分析。 每個檢測項目應設定其文庫質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標準。
3. NGS測序 儀上機檢測及其質(zhì)量分析：測序主要有檢測氫離子釋放和熒光信號兩大技術(shù)平臺。 測序時根據(jù)檢測樣本量和質(zhì)量要求確定適當?shù)男酒愿咝y序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。 錄入樣本編號、檢測內(nèi)容、設定參數(shù)等信息，按儀器操作流程進行測序。 產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)要求詳見后文。
4. NGS檢測中的樣本追蹤及對照設置：（1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNV位點或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行SNV位點信息的測定，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染。 （2）陽性對照：應用組合型質(zhì)控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。 實驗時同時檢測，以確保其檢出能力。（3）陰性對照：用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。 （4）應對方案和替代方法：各個質(zhì)量控制步驟中如出現(xiàn)異常或失敗，實驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結(jié)果質(zhì)量差或有問題的區(qū)域應建立替代方法（如Sanger測序）。

四、生物信息分析

NGS數(shù)據(jù)的生物信息分析可分為兩個主要步驟：一是對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析及過濾。 二是對通過質(zhì)控的序列進行變異位點鑒定分析并注釋。 所用各種生物信息分析軟件，都要通過適量標準品測序數(shù)據(jù)進行驗證，證明所用軟件及參數(shù)可達到臨床報告的要求。

1. NGS 生物信息分析流程標準：（1）質(zhì)控分析：為高效分析結(jié)果的高效性，需要對原始的測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制與過濾。 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制主要包含4個方面：質(zhì)量評估、去接頭序列、去低質(zhì)量序列、去重復序列。 （2）序列比對：將通過質(zhì)控后每一條read 與參考基因組進行比對，回貼到基因組上賊佳位置。（3）變異鑒定：對每個位點進行變異鑒定。在腫瘤 panel 測序中，主要檢測SNV和Indel兩種突變類型，參數(shù)調(diào)整后可分析CNV。 部分panel的設計還可以鑒定染色體易位。 對于腫瘤panel基因測序數(shù)據(jù)，鑒定后的變異位點都需要進行該位點可視化查看和確認，如The Integrative Genomics Viewer（IGV）。（4）變異注釋：基于通用數(shù)據(jù)庫，對突變基因位點進行功能注釋，詳見下文。
2. NGS生物信息分析流程質(zhì)量管理：實驗室應建立生物信息學程序（Pipeline）的書面質(zhì)量管理計劃文件。 必須包含每次運行時監(jiān)測和評估運行性能的指標和質(zhì)控參數(shù)，以及定期（例如每月、每季度）監(jiān)測的指標和質(zhì)控參數(shù)。 指標和質(zhì)控參數(shù)可包括但不限于標準品的突變類型及百分比。 生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類型和變異頻率的標準品進行驗證，驗證其特異度和靈敏度是否達到實驗室要求。 驗證結(jié)果簽名留底備案。 （1）NGS 數(shù)據(jù)存儲：實驗室需要在生物信息分析過程中對原始數(shù)據(jù)及賊后的結(jié)果數(shù)據(jù)進行標準化存儲，并要保存相應的年限以備檢查。 （2）版本可追溯性：每份病例數(shù)據(jù)分析報告中，生物信息數(shù)據(jù)分析流程所涉及軟件、算法、參數(shù)及數(shù)據(jù)庫的版本必須可溯源。 （3）異常記錄：實驗室需要建立一個異常記錄文檔，用來記錄偏離NGS生物信息分析標準分析流程的檢測。
3. NGS生物信息分析質(zhì)量指標：原始文件及比對結(jié)果文件的質(zhì)量指標見表1。
   表1 原始文件及比對結(jié)果文件的質(zhì)量指標含義

    

   參數(shù)	指標含義
   單堿基質(zhì)量	評估read中每個堿基的質(zhì)量分數(shù)
   堿基質(zhì)量中位數(shù)	每條read末端堿基質(zhì)量明顯下降，堿基質(zhì)量中位數(shù)是衡量這段 read的重要指標
   重復read的百分比	重復read 的百分比是文庫復雜度的指示值
   包含接頭序列的read 數(shù)量	包含接頭序列的read總數(shù)
   回貼read的百分比	回貼到參考基因的read百分比
   目標區(qū)域read百分比	回貼到目標區(qū)域的read百分比
   目標區(qū)域的平均深度	目標區(qū)域的平均測序深度
   目標區(qū)域測序均一度	目標區(qū)域被覆蓋到的一致性

4. NGS數(shù)據(jù)存儲格式標準：為了規(guī)范和管理各類數(shù)據(jù)，各個實驗室需按照編號進行數(shù)據(jù)管理，所有數(shù)據(jù)按照國際標準格式進行存儲。 必須建立本地變異數(shù)據(jù)庫（用于檢驗變異真實性）。
5. NGS數(shù)據(jù)存儲傳輸及共享安全標準：實驗室需要制定規(guī)章制度以確認測序數(shù)據(jù)在內(nèi)部、外部存儲及傳輸過程中的安全性和機密性。 正常人群的變異數(shù)據(jù)應該共享。

五、NGS結(jié)果解釋及報告

1. NGS 臨床報告包含內(nèi)容：基于高通量測序技術(shù)，臨床實驗室比較容易獲取更高通量的臨床樣本檢測數(shù)據(jù)，不可避免會檢測到意義未知的變異位點，
   在實際工作中會有一定的不確定性。 但NGS的檢測報告建議體現(xiàn)以下內(nèi)容：
   （１）檢測名稱，如XXX基因變異檢測報告。
   （２）患者基本信息：姓名，年齡，性別，住院號，送樣醫(yī)院科室及醫(yī)師等。
   （３） 樣本信息：病理號，取材部位，樣本類型（FFPE組織、新鮮組織、血液等）、送檢日期、報告日期等。
   （４）病理信息：腫瘤組織類型、位置、TNM分期、細胞含量、腫瘤細胞比例、特殊說明（出血、壞死、酸脫鈣處理等）。
   （５）檢測技術(shù)：包含所用基因panel、檢測平臺名稱，分析軟件版本號等。
   （６）結(jié)果列表應包含：基因名稱、變異在染色體位置、變異頻率、cDNA 的Genbank 號（NM 開頭）及符合人類基因組變異協(xié)會（Human Genome Variation Society ，HGVS）書寫規(guī)范的突變類型、 編碼蛋 白Genbank 號 （NP開頭） 及突變類型、雜合/純合狀態(tài)等。
   （７）臨床意義解讀和批注：體細胞突變，報告各個腫瘤檢測到的變異位點及臨床意義。 胚系突變，對于檢測到的變異位點的致病性予以相應的臨床解釋。 臨床意義解讀要客觀平實的描述，對于疾病相關(guān)性只描述既往研究中的療效或預測，不能出現(xiàn)使用何種治療手段或策略的語言。
   （８）若檢測失敗，應闡述失敗原因。
   （９）賊終報告應由檢測者、報告醫(yī)師或指定審核人聯(lián)合簽發(fā)。
2.  基因變異的命名：在描述所檢測出的基因變異時要遵循一定的原則和規(guī)范，推薦使用人類基因組變異協(xié)會命名指南（www.hgvs.org）。對于遺傳病相關(guān)基因變異命名，推薦美國醫(yī)學遺傳學學院（American College of Medical Genetics and Genomics; https://www.acmg.net）的遺傳疾病變異分類指導的命名、遺傳背景說明以及權(quán)威文獻說明。
3. 臨床意義的解讀和批注：對于腫瘤體細胞突變，根據(jù)突變的類型和已有的報道及指南，基因變異提倡分級的處理方式。
   A級：美國食品藥品管理局（FDA）或CFDA批準的用藥治療靶點；寫入中外診療指南有明確診斷/治療/預后意義的變異。 在報告中注釋該變異位點的臨床診斷/治療/預后意義的權(quán)威指南來源。B級：尚未進入診療指南，但已經(jīng)寫入該領(lǐng)域的專家共識的變異位點。 注釋時要批注研究報道及專家共識的來源，明確其藥物及其臨床意義、正在開展的狀態(tài)等信息。
   C級：FDA或CFDA 批準用于其他腫瘤可預測療效的基因變異，或者正在進行中的臨床試驗變異位點。 注釋時要批注用于其他腫瘤的權(quán)威指南，研究文獻及臨床試驗正在開展的狀態(tài)等信息。
   D級：處于學術(shù)爭議或臨床意義不明確的基因變異。 同一實驗室應該有統(tǒng)一的政策用來應對檢測過程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況［４］ 。
   對于以上幾種情況在報告的時候注意客觀平實地描述檢測的結(jié)果，在病理報告中不能出現(xiàn)建議使用何種治療手段或策略的語言。
   對于胚系突變（germline mutation）檢測，除了中外診療指南及重要參考文獻以外，推薦兩個數(shù)據(jù)庫：Online Mendelian Inheritance in Man（http：//omim.org/）和美國醫(yī)學遺傳學學院（https://www.acmg.net）的遺傳疾病變異分類指導注釋臨床意義，并附上數(shù)據(jù)庫和參考文獻內(nèi)容。遺傳注釋還可以參考各亞?？频膶I(yè)數(shù)據(jù)庫進行注釋（比如乳腺癌BRCA1/2基因等）。
4. 意義不明位點的處理：由于通量的增加和人種差異，臨床腫瘤樣本可能發(fā)現(xiàn)新的變異位點。 實驗室必須制定相關(guān)政策方案用來應對檢測過程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。 政策可以是一發(fā)現(xiàn)變異就報告，但附上說明和意義。 也可以是不報告這些發(fā)現(xiàn)或只報告小部分變異結(jié)果，并附上說明和參考文獻及數(shù)據(jù)庫。 但是在報告的備注里一定要聲明本實驗室的報告規(guī)則。
5. 知情同意：建議提供患者手寫或在線版的知情書。